何天富，陈晓艺，吴玉强，罗宇东，陈 清

（1.广西中医药大学制药厂，广西 南宁 530023；2.广西中医药大学，广西 南宁 530200）

五指精蓝颗粒是根据壮族民间防治慢性疲劳综合征的常用药物筛选而来，由五指毛桃、黄芪、绞股蓝、黄精、人参等药材组成。现代研究表明，方中多种药材具有抗衰老、调节免疫、抗炎、抗肿瘤等作用［1-10］。本课题组拟将五指精蓝颗粒研制开发为用于提高免疫功能的保健食品，前期工作已进行了提取工艺研究［11］，本研究通过对五指精蓝颗粒迟发型变态反应、血清溶血素测定（体液免疫）、小鼠碳末廓清（小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能）及刀豆蛋白A（ConA）诱导小鼠脾淋巴细胞转化能力进行实验研究，探讨其对实验小鼠免疫功能的影响，为五指精蓝颗粒的开发提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物 SPF级健康成年KM小鼠200只，雌性，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证：SCXK（京）2016-0011。实验动物室温度：22～25℃，相对湿度：55～75℃。实验动物使用许可证：SYXK桂2016-0006。

1.2 药物 五指精蓝颗粒提取稠膏（由广西中医药大学制药厂提供，批号：20181001；每克稠膏含生药材5.2 g，）；复方扶芳藤合剂（广西中医药大学制药厂产品，批号：20171201）。

1.3 仪器与试剂 TDL-5-A型离心机（上海安亭科学仪器厂）；全波长全自动多功能酶标仪（美国赛默飞）；RPMI1640培养液、胎牛血清、2-ME（2-巯基乙醇）、青霉素、链霉素、ConA、异丙醇、MTT（噻唑蓝）、Hank’s液（Hank’s平衡盐溶液）、PBS缓冲液（磷酸盐缓冲盐溶液）、台酚蓝、绵羊红细胞（SRBC）、生理盐水、鸡红细胞、SA缓冲液、豚鼠血清、都氏试剂、DNFB（4-二硝基氟苯），以上试剂均为南京建成生物工程研究所产品。

2 方法

2.1 小鼠碳末廓清实验 取小鼠50只，随机分为5组：空白对照组、阳性对照组和五指精蓝颗粒低、中、高剂量组，每组10只。五指精蓝颗粒低、中、高剂量组分别灌胃给予五指精蓝颗粒提取稠膏溶液3.9 g/kg、7.8 g/kg、15.6 g/kg（相当于口服推荐用量的5、10、20倍），阳性对照组灌胃给予复方扶芳藤合剂7.5 ml/kg（相当于口服用量的10倍），空白对照组给予等体积的蒸馏水。动物灌胃容积均为20 ml/kg，每天灌胃1次，连续灌胃30 d。末次灌胃24 h后，每只小鼠按10 ml/kg尾静脉注射印度墨汁（以生理盐水4倍稀释），于注入墨汁后第2 min、10 min，分别从内眦静脉丛取血20µl，加入到2 ml 0.1%Na2CO3溶液中，摇匀。以Na2CO3溶液作空白对照，于600 nm波长测定各管吸光值（OD）。处死小鼠，取肝、脾脏及胸腺，称重，计算脏器/体重比值和吞噬指数（a）。a=K1/3×体重/（肝重+脾重），K=（lgOD1－lgOD2）/（t2-t1）。

2.2 血清溶血素实验 动物分组及给药同2.1项。末次灌胃24 h后，每鼠腹腔注射2%SRBC悬液0.2 ml，免疫5 d后摘眼球取血，2 000 r/min离心10 min分离血清，取血清用SA缓冲液稀释200倍，取稀释后的血清1 ml置试管内，对照管取1 ml SA缓冲液，依次加入10%（V/V）SRBC 0.5 ml、1∶8 SA稀释的豚鼠血清1 ml。置37℃水浴中孵育20 min后，冰浴终止反应。2 000 r/min离心10 min。取上清液1 ml，加都氏试剂3 ml，另取10%（V/V）SRBC 0.25 ml加都氏试剂至4 ml于另一支试管内，充分混匀，作为半数溶血值。放置10 min后，于540 nm波长测定各管吸光度值，计算血溶素水平（HC50）。HC50=样品OD/SRBC半数溶血时的OD×稀释倍数。

2.3 迟发型超敏反应（DTH）实验 动物分组及给药同2.1项。末次给药24 h后，用硫化钡将小鼠腹部皮肤脱毛约3 cm×3 cm范围，涂以1%DNFB溶液（丙酮∶麻油=1∶1）50µl致敏，5 d后将10µl DNFB均匀涂抹于小鼠右耳两面，24 h后颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳廓，用打孔器取下8 mm直径的耳片、称重，以左右耳重量之差值表示DTH的程度。

2.4 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验（MTT法）动物分组及给药同2.1项。末次给药后处死小鼠，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，制成细胞悬液，经200目筛网过滤。用Hank’s液洗2次，每次离心10 min（1 000 r/min）。然后将细胞悬浮于1 ml完全培养液中，计数活细胞数，用RPMI 1640培养液调整细胞浓度为3×106个/ml。再将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1 ml，在其中一孔加75µl ConA液（相当于7.5µg/ml），另一孔作为对照，置5%CO2，37℃二氧化碳孵箱中培养72 h。培养结束前4 h，每孔轻轻吸去上清液0.7 ml，加入0.7 ml不含小牛血清的RPMI 1640培养液，同时加入MTT（5 mg/ml）50µl/孔，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1 ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行孔，用酶标仪于570 nm波长测定光密度值。淋巴细胞的增殖能力=加ConA孔的光密度值-不加ConA孔的光密度值。

2.5 统计学分析 采用SPSS16.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间差异采用方差分析。P<0.05为差异有显著性意义。

3 结 果

3.1 五指精蓝颗粒对小鼠体质量的影响 见表1。与空白对照组比较，五指精蓝颗粒各剂量组和阳性对照组对小鼠体质量增长的影响无显著性差异（P>0.05），提示五指精蓝颗粒对小鼠的体质量增长无明显影响。

表1 五指精蓝颗粒对小鼠体质量的影响 （g，±s）

表1 五指精蓝颗粒对小鼠体质量的影响 （g，±s）

组 别空白对照组阳性对照组五指精蓝颗粒低剂量组五指精蓝颗粒中剂量组五指精蓝颗粒高剂量组n 10 10 10 10 10初始体重21.16±0.82 20.27±1.06 21.82±0.61 21.96±0.70 21.30±0.66末期体重35.24±2.25 33.21±2.94 34.26±2.86 35.35±2.89 35.24±1.74增重14.08±1.71images/BZ_75_1657_1321_1657_1326.png12.94±1.08 12.44±0.92 13.39±1.01 13.94±1.23

3.2 五指精蓝颗粒对小鼠脏器/体重比值的影响 见表2。与空白对照组比较，五指精蓝颗粒各剂量组和阳性对照组小鼠的胸腺/体重及脾脏/体重比值无显著性差异（P>0.05），提示五指精蓝颗粒对小鼠免疫器官的重量无明显影响。

表2 五指精蓝颗粒对小鼠脏器/体重比值的影响（%，±s）

表2 五指精蓝颗粒对小鼠脏器/体重比值的影响（%，±s）

组 别空白对照组阳性对照组五指精蓝颗粒低剂量组五指精蓝颗粒中剂量组五指精蓝颗粒高剂量组n 10 10 10 10 10胸腺/体重0.47±0.15 0.49±0.09 0.43±0.08 0.46±0.07 0.49±0.06脾脏/体重0.44±0.18 0.54±0.16 0.42±0.11 0.41±0.07 0.49±0.15

3.3 五指精蓝颗粒对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响 见表3。与空白对照组比较，阳性对照组、五指精蓝颗粒高剂量组的吞噬指数显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），提示五指精蓝颗粒能有效提高小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能。

表3 五指精蓝颗粒对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响 （±s）

表3 五指精蓝颗粒对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响 （±s）

注：与空白对照组比较，①P<0.05

组 别空白对照组阳性对照组五指精蓝颗粒低剂量组五指精蓝颗粒中剂量组五指精蓝颗粒高剂量组n 10 10 10 10 10吞噬指数3.32±1.04 4.38±0.77①3.18±0.80 2.88±0.47 4.65±0.70①

3.4 五指精蓝颗粒对小鼠体液免疫的影响 见表4。与空白对照组比较，阳性对照组和五指精蓝颗粒高剂量组的血清溶血素水平（HC50值）显著升高，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），提示五指精蓝颗粒能有效提高小鼠血清溶血素水平。

表4 五指精蓝颗粒对小鼠血清溶血素的影响（±s）

表4 五指精蓝颗粒对小鼠血清溶血素的影响（±s）

注：与空白对照组比较，①P<0.05，②P<0.01

组 别空白对照组阳性对照组五指精蓝颗粒低剂量组五指精蓝颗粒中剂量组五指精蓝颗粒高剂量组n 10 10 10 10 10 HC50 88.79±2.87 92.69±2.37①89.15±3.95 88.96±3.75 95.56±0.74②

3.5 五指精蓝颗粒对小鼠细胞免疫的影响 见表5。与空白对照组比较，阳性对照组、五指精蓝颗粒高剂量组小鼠左右耳片重量差值显著升高，差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05），提示五指精蓝颗粒对小鼠迟发型变态反应有明显影响。

表5 五指精蓝颗粒对小鼠迟发型变态反应的影响（mg，±s）

表5 五指精蓝颗粒对小鼠迟发型变态反应的影响（mg，±s）

注：与空白对照组比较，①P<0.01，②P<0.05

组 别空白对照组阳性对照组五指精蓝颗粒低剂量组五指精蓝颗粒中剂量组五指精蓝颗粒高剂量组n 10 10 10 10 10左右耳片重量差值1.14±0.88 2.98±1.12①1.41±0.89 1.29±0.75 2.31±0.83②

3.6 五指精蓝颗粒对ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化能力的影响 见表6。与空白对照组比较，阳性对照组和五指精蓝颗粒高剂量组小鼠的淋巴细胞转化能力明显升高，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），提示五指精蓝颗粒能有效提高小鼠淋巴细胞转化能力。

表6 五指精蓝颗粒对小鼠淋巴细胞转化能力的影响（±s）

表6 五指精蓝颗粒对小鼠淋巴细胞转化能力的影响（±s）

注：与空白对照组比较，①P<0.01，②P<0.05

组 别空白对照组阳性对照组五指精蓝颗粒低剂量组五指精蓝颗粒中剂量组五指精蓝颗粒高剂量组n 10 10 10 10 10淋巴细胞增殖能力（OD值）0.192±0.004 0.220±0.004①0.191±0.012 0.197±0.010 0.218±0.007②

4 讨论

本研究按《保健食品检验与评价技术规范》对五指精蓝颗粒分别进行了迟发型变态反应、血清溶血素测定、小鼠碳末廓清及ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化能力实验。实验结果表明，五指精蓝颗粒对小鼠的体重增长、脏器系数（胸腺、脾脏）等无明显影响，表明五指精蓝颗粒对小鼠免疫器官无影响。单核-巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节等重要作用，其吞噬机能是反映机体非特异性免疫功能的主要指标之一［12］。实验结果表明，五指精蓝颗粒高剂量组的吞噬指数高于空白对照组，差异有统计学意义，表明五指精蓝颗粒可有效提高单核-巨噬细胞的吞噬功能。血清溶血素能反应机体的体液免疫［13］，五指精蓝颗粒高剂量组血清溶血素水平（HC50值）显著提高，与空白对照组比较，差异有统计学意义，提示五指精蓝颗粒对体液免疫有明显的促进作用。五指精蓝颗粒高剂量组小鼠左右耳片重量差值及淋巴细胞转化能力均高于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05），表明五指精蓝颗粒对小鼠迟发型变态反应有明显影响，可有效提高小鼠的淋巴细胞转化能力。

综上所述，五指精蓝颗粒对小鼠体液免疫、单核-巨噬细胞功能、细胞免疫功能均有一定增强作用。