李清平，陈晓艺，谭安蔷，罗宇东，庞宇舟，秦超燕

（1.广西中医药大学制药厂，广西 南宁 530023；2.广西中医药大学，广西 南宁 530200；3.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种发生在滑膜关节及其他器官系统的慢性全身性疾病，表现为滑膜炎持久反复发作，导致关节内软骨和骨的破坏，关节功能障碍，严重危害人类健康，致残率高，严重者会导致患者丧失生活、工作能力，甚至死亡［1］。类风湿性关节炎发病率呈逐年增加趋势，目前尚缺乏特效的治疗药物。广西名中医庞宇舟教授运用古代经方“蠲痹汤”治疗类风湿性关节炎取得满意疗效［2-5］，为方便临床应用及患者携带，本课题组拟将其研发为蠲痹颗粒。本实验中采用正交试验对蠲痹颗粒的最佳水提工艺进行筛选，为蠲痹颗粒的提取工艺研究提供科学依据。

1 实验材料

1.1 仪器 752型紫外-可见分光光度计（上海光学仪器厂）；SQP型电子天平［塞多利斯科学仪器（北京）有限公司］；KQ5200型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药 芦丁对照品（批号：760706；纯度≥99.0%）购自中国食品药品检定研究院；乙醇、甲醇等试剂均为分析醇。

2 方法与结果

2.1 因素水平设计 选取对水提工艺影响较大的加水量、煎煮时间、煎煮次数作为考察因素，选用L9（34）正交试验表进行重复试验，因素水平见表1。

表1 因素水平表

2.2 样品的制备 按处方比例称取羌活、独活、桂心等药材42.9 g，共9份，按表2正交试验方案安排进行提取，合并各提取液，过滤，浓缩，转至蒸发皿中置水浴锅上蒸干，再放入烘箱中80℃干燥，干浸膏研细储藏备用。

2.3 总黄酮的含量测定

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品适量，加乙醇溶解制备成每毫升含0.051 7 mg芦丁的对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 精密称取干浸膏细粉3 g，置索氏提取器中，加氯仿加热回流提取至无色，弃去氯仿液；药渣挥去氯仿，加甲醇，提取至无色，过滤；提取液蒸干，加乙醇溶解并定容至50 ml容量瓶中，摇匀，即得供试品储备液。精密量取供试品储备液5 ml，加水稀释至25 ml，摇匀，即得供试品溶液。

2.3.3 测定波长的选择 精密量取芦丁对照品溶液1.0 ml，置25 ml容量瓶中，加蒸馏水5.0 ml摇匀，加5%NaNO21.0 ml摇匀，放置6 min，加10%Al（NO3）31.0 ml摇匀，放置6 min，加4%NaOH 10.0 ml，加蒸馏水定容至刻度，摇匀后放置15 min，备用。

将供试品溶液、对照品溶液显色处理后，在400～700 nm范围内进行扫描。结果对照品溶液和供试品溶液的最大吸收峰同在510 nm处，没有其他成分的干扰，由此可以选定测定波长为510 nm。

2.3.4 芦丁标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液0.5 ml、1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml，分别置于25 ml容量瓶中，根据显色测定法进行测定。以吸光度为纵坐标（Y），芦丁浓度（X，mg/ml）为横坐标进行线性回归，得回归方程为Y=11.877X+0.000 6（r2=0.999 8）。结果表明芦丁浓度在0.010 38～0.083 04 mg/ml范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.3.5 精密度试验 精密吸取6份芦丁对照品溶液2.0 ml，分别置于25 ml量瓶中，显色，测定吸光度。结果6份样品的吸光度RSD为0.38%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别在0 min、5 min、10 min、20 min、40 min、60 min进行显色、测定。结果供试品溶液在60 min内稳定性良好，RSD为0.64%（n=6）。

2.3.7 重复性试验 取同一批浸膏（正交试验3号），按“2.3.2”项方法制备6份供试品溶液，显色，测定吸光度。结果6份供试品溶液吸光度的RSD为1.76%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的浸膏6份，按照供试品溶液方法制备，每份精密吸取1.5 ml，置于25 ml容量瓶中，再分别精密加入相同量芦丁对照品溶液，最后加甲醇至6 ml，于510 nm波长下测定总黄酮的含量，根据所测得的相关数据计算回收率。结果显示，6份溶液加样回收率为97.7%～102.0%，平均加样回收率为100.23%（RSD<2.0%），符合含量测定要求。

2.3.9 总黄酮含量测定 取“2.3.2”项下方法制备的1~9号供试品溶液，于波长510 nm处测定吸光度，计算出样品中总黄酮的含量。以总黄酮含量和浸膏得率作为提取工艺的主要考察指标，以二者加权综合评分为评价指标。浸膏得率（%）=浸膏重量/样品重量×100%。综合评分=（浸膏得率/浸膏得率最大值×0.5+总黄酮含量/总黄酮含量最大值×0.5）×100。结果见表2。

表2 正交试验方案安排及结果

表2中极差（R）显示，各因素对考察指标影响顺序为C>B>A，即煎煮次数>提取时间>加水量。直观分析表明，A1>A3>A2、B2>B3>B1、C3>C2>C1，表3方差分析结果显示，在所设计的因素范围内，因素B（煎煮时间）和因素C（煎煮次数）对实验结果有显著性影响，而因素A（加水量）对实验结果则无显著性影响，与直观分析结果一致。因此，确定最佳组合为A1B2C3，即加8倍量水煎煮3次，每次1.5 h。

表3 方差分析结果

2.4 验证试验 为验证正交试验结果的准确性，确保提取工艺合理可行，按上述优选出的最佳水提工艺（A1B2C3）重复安排3批实验，结果见表4。

表4 验证试验结果

验证结果表明，按筛选出的最佳水提工艺制备蠲痹颗粒，所得到的干膏得率、总黄酮含量都接近正交试验中的最大值，RSD值均小于2.0%，表明此工艺稳定，具有良好的可操作性和重现性。

3 讨 论

“蠲痹汤”出自清代程钟龄的《医学心悟》，为治疗类风湿关节炎的经典名方，由羌活、独活、桂心、秦艽、当归、川芎、甘草（炙）、海风藤、桑枝、乳香、木香等11味药材组成。临床观察发现，该方对改善由活动性RA引起的身体烦痛、项背拘急、手足冷痹、腰膝沉重、举动艰难等临床症状、体征及降低急性期反应物指标方面，疗效确切［6-9］。根据国家药品注册法规要求，本课题组拟将其开发成古代经典名方类新药，由于原方临床使用为汤剂，因此本课题组在选择提取工艺时优先考虑水提工艺。

本方由多味中药组成，成分复杂，选取某个单一成分作为检测指标，都不能全面评价提取工艺的适用性和可靠性。黄酮类化合物广泛存在于大自然中，具有抗炎、抗氧化、镇痛等多方面的药理活性［10］，故课题组选取簇群药效活性成分——黄酮类化学成分为检测指标，以总黄酮的含量和浸膏得率的加权综合评分为评价指标，对评价提取工艺具有实际意义。本试验优选出蠲痹颗粒最佳水提工艺条件为：加水8倍量煎煮3次，每次1.5 h。验证结论也表明此工艺稳定，具有良好的重现性和可操作性，可为实际生产提供参考依据。