◎ 郝 果，安晓娟，王琳帆

（富平县检验检测中心，陕西 富平 711700）

脱氢乙酸及其钠盐作为食品添加剂，是继苯甲酸钠、尼泊金、山梨酸钾之后新一代的低毒高效的防腐剂，对霉菌和酵母菌的抑菌能力强，为苯甲酸钠的2～10倍，高剂量时能有效抑制细菌繁殖。脱氢乙酸及其钠盐被人体各个组织吸收后分散于血浆和众多器官中，抑制体内多种氧化酶发挥作用。长期大量食用脱氢乙酸及其钠盐超标的食品，会对人体健康产生一定影响[1-2]。

目前常用的防腐剂主要有：山梨酸、苯甲酸和丙酸及其盐类；没食子酸、没食子酸酯、对羟基苯甲酸酯类、棕榈酸酯、抗坏血酸；亚硫酸盐、焦亚硫酸盐；乳链球菌和为他霉素；茶多酚、壳聚糖等。脱氢乙酸及其钠盐作为一种新型防腐剂具有突出的优点，可耐光、耐热，且在食品加工过程中不分解或蒸发，不产生异味，近年普遍受到广大食品企业的欢迎[3]。脱氢乙酸及其钠盐对霉菌、酵母菌、细菌具有良好的抑制作用，其机制是通过抑制微生物的呼吸，可有效渗透到细胞体内，以起到防腐、防霉、保鲜等作用，抑制有效浓度为0.5～1.0 g·kg-1，一般用量为 0.3～0.5 g·kg-1。主要用于黄油、腌渍蔬菜、发酵豆制品、淀粉制品、面包、糕点、焙烤食品、肉制品、复合调味品和果蔬汁，糕点中最大用量为0.5 g·kg-1[4]。食品中脱氢乙酸的测定方法有很多，包括气相色谱-质谱联用法[5]、气相色谱法[6-7]、液相色谱法[8-9]等，其中高效液相色谱法因普及率高、准确性好而被广泛应用。

《食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定》处理复杂耗时。本研究参照GB 5009.121—2016，主要采用高效液相色谱-紫外检测器，用硫酸锌溶液沉淀样品中的蛋白质，再用正己烷除去脂类及糖类等物质，最后离心过滤，减少了杂质峰的干扰，同时确定了检测器条件，建立了一种准确、快速、灵敏度高的糕点类食品中脱氢乙酸含量的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）、CPA224S电子分析天平（德国赛多利斯仪器有限公司）、KQ-700VDB超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、HC-3018离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）。

脱氢乙酸标准物质（纯度99.0%，北京坛墨质检科技有限公司）；C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm，150 A，美国安捷伦科技有限公司）；氢氧化钠、乙酸锌（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；正己烷（色谱纯，美国sigma公司）；水为实验室自制超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

流 动 相：甲 醇：0.02 mol·L-1，乙 酸 铵 水 溶 液（10∶90，V∶V）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：293 nm。

1.2.2 样品前处理

糕点：精确称取样品2 g，放入25 mL离心管中，加10 mL水，5 mL 120 g·L-1的硫酸锌溶液，用20 g·L-1的氢氧化钠溶液调pH至7.5后转移至25 mL的容量瓶中，用水定容，摇匀。将混合液转移到离心管中，超声10 min，然后转移至分液漏斗中，加10 mL正己烷，振摇1 min后静置，待分层后弃去有机层，再加10 mL 正己烷重复提取1次，将下层水相置于离心管中， 4 000 r·min-1条件下离心10 min。最后取上清液过 0.45 μm有机滤膜，进高效液相色谱仪测定。

1.2.3 标准溶液配制

（1）标准储备液（1.0 mg·mL-1的脱氢乙酸标准储备液）配制。准确称取0.100 0 g脱氢乙酸标准品于100 mL容量瓶中，用10 mL 20 g·L-1氢氧化钠溶液溶解，用水定容至刻度线。4 ℃下有效期为3个月。

（2）脱氢乙酸标准工作液配制。分别吸取脱氢乙酸贮备液0.1 mL、1.0 mL、5.0 mL、8.0 mL、10 mL、15 mL、20 mL置于100 mL容量瓶中后用水定容至刻度线，配制成浓度分别为1.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1、80.0 μg·mL-1、100 μg·mL-1、150 μg·mL-1、200 μg·mL-1的系列标准工作液，4 ℃下储存备用。

1.2.4 标准工作曲线绘制

线性是指在一定的浓度范围内，测得的响应值与被测物质浓度成比例关系的程度。以系列标准品的浓度和对应的峰面积分别为横、纵坐标作图，观察是否呈线性。

本实验用脱氢乙酸标准储备液精密配制以下标准系列浓度：1.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1、 80.0 μg·mL-1、100.0 μg·mL-1、150.0 μg·mL-1、 200.0 μg·mL-1，进样量为10 μL，以脱氢乙酸浓度为横坐标、以对应的峰面积为纵坐标制作标准回归曲线，即Y=kX+b。

2 结果与分析

2.1 标准曲线、线性范围

线性结果如图1所示，该方法的浓度范围为1.00～200.0 μg·mL-1，线 性 方 程 为Y=28.783 89X-22.820 36，相关系数r=0.999 84，线性关系良好。

图1 脱氢乙酸的相关系数和回归方程图

2.2 检出限及定量限

以标准曲线斜率法确定检出限，采用样品空白测定10次，平均值加上3倍标准偏差计算出检出限。以标准曲线斜率法确定定量限，采用样品空白值，加上10倍标准偏差计算出定量限。

脱氢乙酸标准品的液相色谱图如图2所示，按检出限和定量限的验证方法，当称样量为2.0 g时，计算得出检出限为0.6 mg·kg-1，定量限为2 mg·kg-1，与 GB 5009.121—2016中方法检出限（2 mg·kg-1）和定量限（5 mg·kg-1）相比，该方法有较高的灵敏度。

图2 脱氢乙酸标准品色谱图

2.3 样品的测定

按照本研究方法对不同样品进行前处理后用高效液相色谱仪进行测定，结果见表1。由测定结果可以看出在3种不同糕点中均检出脱氢乙酸，且精密度为1.1%～2.6%，RSD均小于标准规定的10%。

表1 样品中的脱氢乙酸含量的测定表

2.4 精密度

本研究采用相对标准偏差来评价实验的精密度，精密度越小，说明平行性越好。将浓度为200.0 μg·mL-1的脱氢乙酸标准溶液重复测定7次，分别计算其出峰时间、峰面积以及浓度的相对标准偏差，以此来评价精密度和重复性。

将200.0 μg·mL-1的脱氢乙酸标准品溶液，重复测定7次，分别计算，其保留时间、峰面积和RSD为0.02%、0.20%和0.20%，精密度良好，其结果见表2。精密度越小，准确度越高，数据越可靠。

表2 精密度实验结果表

2.5 加标回收实验

本研究采用样品加标回收，即在有被测物质的样品中加入定量的待测标准物质，按照样品的处理方法进行处理、测定、分析，得到的测定值减去本底值后与理论加标值的比值则为加标回收率。

精密称取9份2 g样品置于25 mL离心管中，分成3组，每组3份平行样品，加入低、中、高3种不同浓度的脱氢乙酸标准溶液，按照样品处理方法进行处理、测定、分析。根据加标回收率公式计算得出其平均回收率。测定结果见表3。从表3中可知其回收率的平均值98.3%，范围为96.4%～101.0%，均在80%～120%范围内，回收率较高，说明本方法对糕点中脱氢乙酸含量的测定能起较好的质控目的。

表3 糕点中脱氢乙酸的回收率表

2.6 检测器的选择

《食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定》中有2种检测方法，一种是气相色谱法，一种是液相色谱法。液相色谱法可用紫外检测器和二极管阵列检测器，但二极管阵列检测器对温度非常敏感，易导致基线不稳定，灵敏度降低，脱氢乙酸在紫外检测器和二极管阵列检测器均有响应，但其在紫外检测器上的响应值较大且灵敏度高，故选择紫外检测器。

3 结论

经过优化选择高效液相色谱条件：色谱柱为C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流动相为甲醇： 0.02 mol·L-1，乙酸铵（10∶90，V∶V）；流速为 1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量10 μL；检测波长293 nm。样品经硫酸锌沉淀蛋白质，正己烷除去油脂和糖类，C18柱分离后，对糕点类样品中脱氢乙酸含量进行测定。通过测定线性范围、检出限、定量限、精密度以及加标回收实验，均得到了满意结果。本方法检出限为 0.6 mg·kg-1，定量限为2 mg·kg-1，优于国标方法，说明本检测方法灵敏度高、准确性好，能很好的测定糕点中脱氢乙酸的含量。