向小华 刘国祥 张兴伟 夏长剑 李媛 陈荣平 杨菁 赵文涛 吴达 李方友 吕洪坤

摘 要：为准确评价雪茄烟种质资源的遗传多样性，利用SSR引物对92份可用作雪茄烟原料的种质进行分析，共检测到234个等位基因，平均为5.441 9，每个位点的多态性信息量变化范围为0.099 5～0.846 9，平均值为0.608 2;Neis多样性指数平均为0.654 6，Shannon信息指数平均达1.303 5。UPGMA聚类分析在遗传距离0.35处可将供试种质分为4个类群，PCA主成分分析将供试材料划分为4个类群，Structure群体遗传结构分析将供试材料划分为5个类群;不同分析方法划分的类群虽然有所差异，但分析结果均与地理来源有一定的相关性。从中筛选出15对核心引物构建了供试种质的指纹图谱，为建立雪茄烟种质资源鉴定体系奠定理论基础。本研究可为雪茄烟鉴定评价、遗传背景研究和种质创新应用等提供科学依据。

关键词：雪茄烟;种质资源;SSR标记;遗传多样性;指纹图谱

Abstract： In order to evaluate the genetic diversity of cigar germplasm resources accurately， 92 cigars were analyzed with SSR primers. A total of 234 alleles were amplified and the average number was 5.441 9. The polymorphic information content of each locus varied from 0.099 5 to 0.846 9 with an average of 0.608 2. The average diversity index of Nei was 0.654 6， and the average of Shannon information index was 1.303 5. Unweighted pair-group method with arithmetic means cluster analysis showed that the tested cigar resources can be divided into 4 groups at the genetic distance of 0.35. The test materials were divided into 4 groups by principal component analysis and 5 groups by structure population genetic structure analysis. Although there were some differences in the groups divided by different analysis， the results were all related to the geographical origin. 15 core-primers were screened to construct the fingerprint database of the tested germplasms， which laid a theoretical foundation for the establishment on the identification system of cigar germplasm resources. This study provided scientific reference for cigar identification and evaluation， genetic background research， germplasm innovation and application.

Keywords： cigars; germplasm resources; SSR marker; genetic diversity; fingerprinting

雪茄是一种特殊的烟制品，传统概念是全部用烟叶卷成的吸用烟卷，具有雪茄香型且香气浓郁，劲头大，烟气呈碱性，焦油与烟碱比值小[1-2]。烟叶是雪茄的核心，其质量和组成配方决定了雪茄的风格特色。生产优质雪茄烟叶需要适宜的气候、土壤、地形条件以及丰富的种植经验，世界上公认的种植雪茄煙叶最好的国家有古巴、多米尼加、印度尼西亚、美国、洪都拉斯等[3]。受环境、品种、栽培措施等因素的影响，我国雪茄生产仍然以进口烟叶作为主要原料，在很大程度上制约了中国雪茄产业的发展[4]。

我国雪茄烟种质资源十分匮乏，主要来源是国外引种和国内地方优质晾晒烟品种筛选，往往存在同种异名、同名异种、遗传背景不清等问题。因此，有必要利用分子标记技术准确研究其遗传规律，精准鉴定我国雪茄烟资源，为后期品种选育和资源高效利用奠定基础。相较于其他分子标记方法，SSR标记具有操作简便、稳定性高、特异性好等优点，已广泛应用于烟草及其他作物的遗传多样性研究中。BINDLER等[5]公布的第一张烟草SSR标记遗传连锁图谱为SSR分子标记在烟草中的广泛应用奠定了基础。目前，我国利用SSR标记进行遗传多样性研究主要集中在烤烟[6]、晒晾烟[7]、香料烟[8]和野生烟[9]，对于雪茄烟的研究较少。本研究利用SSR标记对92份雪茄烟种质资源进行遗传多样性分析和指纹图谱绘制，以期为雪茄烟种质资源鉴定、育种亲本选择、重要基因挖掘等工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究供试的烟草种质资源由中国烟草总公司海南省公司海口雪茄研究所提供（表1），其中包括41份雪茄烟、31份晒烟、12份晾烟、4份烤烟和4份香料烟，所有种质均具有雪茄烟香气风格且已用于雪茄烟育种，因此作为雪茄烟种质资源进行研究与利用。

1.2 基因组DNA的提取

供试材料于2019年种植在海南省儋州试验基地。采集幼嫩叶片用SLS法提取DNA，加ddH2O溶解后于?20 ℃低温下保存。

1.3 SSR引物

试验所用引物为公共SSR标记，引物合成由六合华大（北京）基因科技有限公司完成。

1.4 PCR扩增

PCR扩增体系10 μL，其中包括1 μL DNA，5 μL 2×Taq Master Mix，ddH2O 2 μL，上、下游引物各1 μL。反应程序为：95 ℃预变性5 min后，95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s，共35次循环，最后72 ℃延伸8 min。PCR扩增产物用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

1.5 数据分析

用DataFormater软件将读取的“0，1”数据进行矩阵转换;用Popgene32软件计算等位基因数（Number of alleles，Na）、有效等位基因（Effective number of alleles，Ne）、Neis基因多样性指数（Nei's gene diversity，H）、Shannons多态信息指数（Shannons information index，I）等;用PIC_CALC Version 0.6软件计算多态信息量（Polymorphic Information Content，PIC）;用MEGA7.0.21软件进行聚类分析，方法采用类平均法（unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）;利用NTSYS-pc 2.10软件进行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）;利用Structure2.3.4软件进行群体遗传结构分析;并在引物分析结果的基础上构建92份雪茄烟资源的指纹图谱。

2 结 果

2.1 遗传多样性分析

数据分析结果显示（表2），观测等位基因数（Na）在2～12之间，平均值为5.21个，其中PT52689的最多（12个）。有效等位基因数（Ne）在1.117 2～7.088 8之间，平均值为3.437 4，占比63.17%。观测杂合度（Ho）在0.136 4～0.894 5之间，平均值为0.341 8;群体平均Shannon′s遗传多样性指数（I）为1.303 5， PT52689最高（2.225 4），PT52176最低（0.214 64）;平均Nei′s多样性指数（H）为0.654 6。期望杂合度（He）的平均值为0.658 2，大于0.5。说明供试雪茄烟种质的遗传多样性较高[8]。引物多态性信息含量（PIC）的变化范围为0.099 5～0.846 9，其中大于0.5的有31对，说明所选引物的多态性较高。

2.2 聚类分析

根据UPGMA法进行聚类分析，结果表明（图1），除YA1（No.9）和红花铁杆子（No.10）、海研201（No.27）和GBX2（No.28）外，利用SSR标记可以将剩余88份雪茄烟资源相互区分开，并在遗传距离为0.35时分为4大类。类群Ⅰ包括康州3号（No.7）、海研101（No.13）、古巴5号（No.14）等42份资源，涵盖了供试种质中来自于古巴的所有资源，占该大类的40.48%;类群Ⅱ包括万毛2012（No.65）和土耳其香料烟（No.67）2份资源;类群Ⅲ包括大白花（No.76）和湖南晒烟（No.77）2份资源;类群Ⅳ包括巴西1号（No.1）、巴西2号（No.2）、红花铁杆子（No.10）等46份资源，以国内资源为主，其中来自于广西的资源占该类资源的30.43%。从聚类图中可以发现，类群Ⅰ以国外资源为主，其中来自古巴的有17份，来自多米尼加、美国、印度尼西亚的各有4份;类群Ⅳ以国内资源为主，其中来自广西的有17份，来自黑龙江的有5份，来自海南、四川的各有4份。虽然同一类群中的种质来源于不同地区，但来自同一产地的种质在聚类图中成簇分布，说明聚类结果与雪茄烟种质的地理来源有一定的相关性。

2.3 主成分分析

主成分分析结果表明，二维、三维主坐标分析图都将供试种质划分为4个类群（图2）：类群Ⅰ包含巴西1号（No.1）等7份種质，其中有5份为巴西引进资源;类群Ⅱ包含海研106（No.11）等10份种质，其中有8份种质来源于古巴;类群Ⅲ包含康州2号（No.6）等67份国内外种质，来源地复杂多样，但来自同一地区的种质在坐标图中聚在一处;类群Ⅳ包含四塘晾烟（No.46）等8份种质，全部来源于广西。通过对比发现，主坐标分析结果与聚类分析有一定的相关性，主成分分析中的类群Ⅰ和类群Ⅲ包含于聚类分析中的类群Ⅳ，主成分分析中的类群Ⅱ包含于聚类分析中的类群Ⅰ。因此得出与聚类分析相同的结果，即雪茄烟种质资源在一定程度上是按照地理来源进化划分的。

2.4 遗传结构分析

利用Structure软件对92份雪茄烟种质进行群体遗传结构分析，由ΔK值确定最优群体数K值，当K=5时ΔK最大（图3-A），表明等位变异频率特征类型数K=5时其模型后验概率最大，因此可将供试种质划分为5个类群（图3-B）。其中第1类群包括巴西1号（No.1）等7份种质，与主成分分析中的类群Ⅰ相同;第2类群包括YA4（No.37）等25份种质，国内资源占68.00%;第3类群包括新靖晾烟（No.44）等17份国内种质，其中12份来自广西;第4类群包括海研106（No.11）等15份国外引进种质，其中13份来自古巴;第5类群包括康州2号（No.6）等28份种质，国外引进资源占60.71%。供试材料的群体遗传结构分析结果与地理来源有一定的相关性，此结果与UPGMA聚类分析和PCA主成分分析的结果基本一致。

2.5 DNA指纹图谱构建

DNA指纹图谱作为种质资源鉴定的重要工具，具有高度的个体特异性和环境稳定性[10]。本研究从供试SSR标记中选取15对核心引物可将92份雪茄烟种质区分开来。根据15对SSR引物的扩增结果（以引物PT60917为例，图4），结合参照分子量标记，参考宋海斌等[11]图谱代码构建方法构建供试雪茄烟资源的指纹图谱（表3）。

3 讨 论

国内自然环境与原产地之间的差异往往导致国外引进的雪茄烟资源不能表现出原有特色[12-13]。目前我国雪茄原料产区主要有海南、四川、湖北和浙江，其中海南省位于23° N以南，与古巴和印度尼西亚的优质雪茄烟种植区纬度相近、土壤相近、气候相同，被认为是我国发展“中式雪茄”最具潜在优势的地区之一[14-16]。本研究将中国烟草总公司海南省公司海口雪茄研究所收集到的雪茄烟种质资源种植于海南省儋州市，可将供试种质的雪茄风格最大化地发挥出来，为“中式雪茄”的研究提供优质育种材料。

利用分子标记研究种质资源遗传多样性不易受外界环境条件影响，是目前为止最有效的遗传分析方法[17]。本研究利用SSR标记对92份雪茄烟种质资源进行遗传多样性分析，结果表明，供试种质平均等位基因数为5.441 9，平均多态性信息量为0.608 2，说明引物总体上有较好的鉴别能力;Neis多样性指数平均值为0.654 6，期望杂合度平均值为0.658 2，遗传相似性系数为0.095～1.000，说明供试种质代表性广泛，遗传多样性丰富，这与供试种质的地理来源差异较大有关[18]。

聚类分析、主成分分析和遗传结构分析结果上存在一定差异：聚类分析在遗传距离为0.35时将供试种质分为4大类，主成分分析将供试种质划分为4个类群，遗传结构分析将供试种质划分为5个类群。综合对比以上3种分析结果发现，主成分分析中的类群Ⅰ和遗传结构分析中的类群1完全相同并包含于聚类分析中的类群Ⅳ;主成分分析中的类群Ⅱ包含于遗传结构分析中的类群4，同时均包含于聚类分析中的类群Ⅰ;主成分分析中的类群Ⅲ包含于遗传结构分析中的类群3，同时均包含于聚类分析中的类群Ⅳ;聚类分析中的类群Ⅱ和类群Ⅲ、遗传结构分析中的类群5均包含于主成分分析中的类群Ⅳ。3种方式存在差异的原因可能是分类方法依据不同：聚类分析依据的是遗传距离，主成分分析依据的是遗传相似系数，反映的都是种质间亲缘关系远近，但易受人为因素的影响，导致二者群体分类差异较大;群体遗传结构分类是基于数学模型之上，计算各供试材料间相应的Q值（第i材料其基因组变异源于第K群体的概率），服从Hardy-Weinberg平衡的群体数目，其结果避免了人为因素对群体划分的影响，具有较高的准确性[19]。虽然3种分析结果不完全相同，但均与地理来源有一定的相关性，在晾晒烟[7]、香料烟[8]和野生烟[9]中也得到了相同的结论。有研究表明[20-22]，烤烟的聚类结果与地域来源关系不大，而与系谱来源相关性较大，原因可能是烤烟育种中使用的骨干亲本基本相似。在聚类分析结果中，YA1（No.9）和红花铁杆子（No.10）、海研201（No.27）和GBX2（No.28）没有区分开，其中YA1（No.9）和红花铁杆子（No.10）分别来源于印度尼西亚和中国四川，并且在主成分分析和遗传结构分析中与5份来自巴西的种质资源划为一类，原因可能是红花铁杆子（No.10）为国外引种却又独立命名;海研201（No.27）和GBX2（No.28）均来源于古巴，可能为重复引种，后期应结合田间表型性状调查结果，进一步确定是否为同一种质。

4 结 论

本研究利用SSR标记对海口雪茄研究所收集到的92份国内外雪茄烟种质资源进行了遗传多样性分析，结果表明，供试种质遗传多样性丰富，代表性广泛;聚类分析和主成分分析将供试种质划分为4个类群，群体遗传结构分析将供试种质划分为5个类群，虽然不同分析方法划分的类群有所差异，但分析结果均与地理来源有一定的相关性，可为雪茄烟的遗传背景研究和育种亲本选择提供科学依据;利用核心引物构建了92份雪茄烟种质资源DNA指纹图谱代码，为建立雪茄烟种质资源鉴定体系奠定了理论基础。

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