张晓

摘要：高效液相色谱（HPLC）是以液体作为流动相，利用样品各组分在流动相和固定相中分配系数或吸附系数的差异来实现不同组分分离的色谱分析技术。该技术具有实用、快速、灵敏、效率高等特点，在医药、环保、石化、生命科学、食品工业等领域有着广泛的应用。高效液相色谱仪在使用过程中常会出现一些影响分析结果的问题，包括鬼峰、保留时间漂移、峰前延、峰拖尾、峰变宽、负峰以及无色谱峰出现等，本文结合笔者多年HPLC操作经验，谈谈上述各种问题产生的原因及其相应的解决方法。

关键词：高效液相色谱技术;常见问题;解决方法

1 常见问题及解决方法

1.1 鬼峰

在液相色谱的洗脱过程中有时会出现实际测试样品中不存在的色谱峰，此类色谱峰称之为鬼峰。鬼峰时有时无，不具备规律性，但它们对目标峰的准确判断产生极大干扰。一般来说，鬼峰产生的原因可能有3个，即样品前处理不当、流动相污染以及测试过程中的样品残留，分述如下。

1.1.1 样品前处理不当

样品前处理不当可能会产生鬼峰，一般源于两个途径：一是所用试剂被污染;二是測试容器不干净。鉴别起来比较简单：使用试剂稀释样品，如果待测样品出峰明显减小而鬼峰变化不大，则鬼峰源自试剂污染。如果洁净容器后重新检测鬼峰消失，则鬼峰源自容器的污染。

1.1.2 流动相污染

鬼峰的产生更多是由流动相污染所致，包括水相、有机相以及添加剂的污染。水相长时间放置或是多次使用没有更换，易滋生细菌等微生物而污染，甚至会溶解空气中悬浮的颗粒和有机物，引入新的污染物。有机相和添加剂如果纯度不够含有杂质，每次补充流动相时以直接补给的方式，没有对贮液瓶进行清洗更换，富集的污染物就会进入到仪器流路中产生鬼峰。

1.1.3 测试样品的残留影响

测试样品的残留也会产生鬼峰。残留物通常来源于三个方面：进样口端污染、测试样品浓度过载残留以及色谱柱和仪器管路中污染物的富集。

在不改变测试条件情况下，如果鬼峰每次有规律地出现在色谱图的相同位置，则污染很可能来自于自动进样器端。这时可将自动进样针和针座拆下，分别用甲醇、丙酮和环己烷进行超声清洗。

1.2 保留时间漂移

保留时间是HPLC分析的重要依据。同一种物质在相同色谱条件下，如果前后两次的保留时间之差超过30s，就可认为保留时间发生了漂移，此时就无法对该物质进行准确的定性定量分析。导致保留时间漂移的因素包括流动相混入空气、系统压力不稳定、色谱柱的性质变化以及环境温度不稳定等。

1.2.1 流动相混入空气

仪器流路中连续混入气泡，样品的保留时间会发生无规律的变化。混入气泡的原因可能有2个，一是在线脱气机脱气不完全，流动相中仍存有大量的空气。这种情况可预先将流动相进行超声脱气处理，然后再装入储液瓶中待用。二是由于水相和有机相的物理化学性质存在差异，两者在相互混合时，增加了空气在两种流动相中的溶解度。对于这种情况的等度洗脱实验，可提前将流动相按所需比例配置好，然后超声脱气待用。

1.2.2 系统压力不稳定

系统压力不稳定直接影响了物质的出峰时间。其中，样品与流动相相容性差、流动相混合器故障、单向阀故障、泵密封垫损坏、仪器管路接口松动及损坏是造成系统压力不稳定的常见因素。

在选择待测组分的溶剂时首先要考虑流动相与样品的相溶性，如没有特殊原因，一般选择流动相作为待测组分的溶剂，以降低由于待测样品在流动相中溶解性差引入的空气量。

液相色谱仪采用动态混合器和静态混合器将不同通道出来的流动相混合均匀。一旦混合器发生故障，待测样品的洗脱效果不一，系统就无法达到平衡，导致压力不稳基线不平。此时应立即停止实验，查明原因，确认是否需要更换部件。

单向阀工作时液体呈单向流动，如果长时间使用缓冲盐作为流动相，少量没被洗脱的缓冲盐结晶会阻塞单向阀的阀门，降低阀的流通性，导致流路流速改变，甚至还会发生单向阀漏液，进而造成系统压力不稳。遇到这种情况，处理办法是取出入口和出口单向阀的阀芯，依次在水、甲醇中超声清洗15min以上。如果单向阀的白色滤头颜色加深变黑，就要直接更换。假如以上方法还不能解决问题，则要检查密封垫圈或者单向阀有否磨损，一旦磨损要及时更换。

1.3 峰变宽

峰变宽会导致相近的两个色谱峰相互重叠，仅以一个峰出现在谱图中，不利于样品的分离检测。出现此类情况，可采取以下措施：（1）改变流速。适当加大流速，可明显改善由流速过低引起的峰变宽现象。（2）重新进样。系统未达到平衡就开始做测试，峰形会发生无规则的变化，可待系统平衡稳定后重新进样。（3）更换柱子。移除色谱柱前端的保护柱，根据峰形变化来判断是保护柱还是色谱柱受到污染。如峰形有明显改善，则需更换保护柱的滤芯。反之，则需清洗或更换色谱柱。（4）调节流动相的比例或者重新选用合适的流动相。

1.4 负峰

负峰在液相色谱图中出现十分频繁，分为以下两种情况：所有峰均为负峰和出现个别负峰。

当色谱图上所有的峰都为负峰时，十之八九是仪器的线路出了问题。这时应检查连接线路，看数据处理系统信号的线是否接反，或记录仪、检测信号极性接反。

液相色谱图中出现一个或多个负峰，原因可能有3个：（1）样品中的溶剂与流动相不一致。如果溶剂的紫外吸收弱于流动相，就会减弱色谱图中某一位移处的信号，溶剂峰呈负峰形式。解决方法是使用流动相作为样品的溶剂。（2）样品前处理中混入了其他杂质。假如杂质的紫外吸收弱于溶剂和流动相，当一定浓度的该类物质流出时，就可能出现负峰。但如果负峰不影响待测组分出峰，就不必对样品作进一步纯化处理。（3）流路中存在气泡。当流路中残留的气泡经过流通池时，色谱图上某一位移处的紫外吸收特别弱，就会出现负峰。碰到这种情况，只有将流路中的气泡排尽才能消除负峰对测试的影响。

2 结语：

高效液相色谱仪是一种操作要求严、技术含量高、实践领会强的大型精密分析仪器，我们只有加强日常维护，在使用中认真应对，及时发现异常，找出原因并予以解决，才能延长仪器的使用寿命，保证检测的准确性，让仪器的功能和特点得到最大限度的发挥和利用。