王洪伸, 林涌鹏, 尹萌辰, 常君丽, 陈博来△

1广州中医药大学第二附属医院骨伤一科(广东广州 510120)； 上海中医药大学附属龙华医院 2骨伤科, 3上海中医药大学脊柱病研究所(上海 200032)

骨肉瘤是起源于骨间叶细胞的原发恶性骨肿瘤，约占恶性骨肿瘤的20%，其发病年龄呈双峰状，75%发生于儿童和青年为原发性；25%发生于中老年为继发性[1-3]。首次确诊后转移患者5年生存率低于30%，具有极高危害性[4]。因此寻找有效的药物治疗靶点临床迫切需要，而DNA损伤与修复途径一直是关注靶点。骨肉瘤DNA损伤后无法及时修复，将逐步导致细胞增殖和分化失控，诱发恶性增殖[4-5]；而DNA损伤修复功能过强，将导致细胞修复加速，增加肿瘤发生率或耐药性和抵抗力[5]。DOT1L催化H3K79甲基化促进DNA损伤修复、端粒酶沉默[6]。有肿瘤细胞测序报道和CBioPortal肿瘤数据库表明，DOT1L在部分肉瘤中呈高表达[7]；而SIRT1在骨肉瘤中呈现促癌基因高表达特性[8-9]，参与DNA双链损伤修复[8]，能够与DOT1L相互作用，增强H3K79甲基化的分布和活性。因此推测DOT1L可能通过DOT1L/H3K79me2-SIRT1及下游途径调控骨肉瘤细胞增殖、凋亡、转移等生物学行为。为验证上述科学假设，2019年1月至2020年9月，本研究首次采用shRNA敲减骨肉瘤细胞DOT1L基因，观察MG63细胞增殖、迁移、DNA损伤的影响，探讨DOT1L成为骨肉瘤治疗新靶点的具体机制与潜能。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人骨肉瘤细胞株MG63购自上海中科院细胞库；MEM培养液和胎牛血清购自美国Gibco公司，DOT1L抗体(ab64077)、XPA抗体(ab85914)、XPC抗体(ab155025)、H3K79me2(ab3594)、Histone H3抗体(ab1791)、β-actin抗体 (ab8227)均购自美国Abcam公司，SIRT1抗体(#8469)购自美国Cell Signaling Technology公司。hDOT1L shRNA TRC系列质粒购自美国GE Healthcare Dharmacon公司。……