李思齐，余学英，何芳

十堰市太和医院（湖北医药学院 附属医院）药学部，湖北 十堰 442000

粗榧Cephalotaxus sinensis又名中国粗榧、粗榧杉，为三尖杉科三尖杉属植物，是著名观赏树种，属国家珍贵树种[1]，分布于我国甘肃、云南、贵州、广东、福建、湖北、安徽等地[2]。粗榧的叶、枝、根、种子均可入药，其中，叶四季均可采用，种子11 月份采用。粗榧因具有较强的抗癌作用，而被称为“抗癌奇木”[3]。研究发现，粗榧中主要含有生物碱类[4-5]、黄酮类[2,6]、内酯类[7]、苯丙素类[8-9]、二萜类[10]等成分。粗榧的研究多集中在生物碱类成分，黄酮类成分的研究较少。目前，对粗榧叶总黄酮的提取多采用正交设计优化其工艺[11]，但正交试验法得到的回归模型精度与预测性较差，直观性差[12]，而采用响应面法优化粗榧叶中总黄酮的超声提取工艺尚未见报道。本研究拟采用Box-Behnken效应面法对超声法提取粗榧叶中黄酮的工艺进行优化，并探讨其抗氧化活性，以期为粗榧的进一步开发利用提供参考。

1 材料

1.1 仪器

GPD-1000C 型中药材粉碎机（台州国品乐机机械有限公司）；BP211D 型十万分之一电子分析天平（德国赛多利斯公司）；UV-2550 型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；KQ-300DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

粗榧叶购自祁州药材堂，经十堰市太和医院陈吉炎教授鉴定为三尖杉科植物粗榧Cephalotaxus sinensis(Rehder et E.H.Wilson) H.L.Li 的干燥叶。对照品芦丁（批号：wkq20030203，四川省维克奇生物科技有限公司）；1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）自由基（批号：20200429，上海宝曼生物科技有限公司）；维生素C（VC，批号：20200105，上海宝曼生物科技有限公司）；2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS，批号：20200624，上海宝曼生物科技有限公司）；乙醇（批号：20191106，国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 标准曲线的建立

采用60%乙醇，超声溶解，制成质量浓度为1.0 mg·mL-1的芦丁对照品溶液。参考文献[13]，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 法于510 nm 处测定其吸光度，以芦丁质量浓度为横坐标（X），吸光度值为纵坐标（Y），制备标准曲线，回归方程：Y=6.003 2X-0.003，r=0.999 7。

2.2 总黄酮得率的计算

称取粗榧叶粉末1.0 g，置于具塞瓶中，加入一定量的适宜体积分数的乙醇，超声法提取黄酮，滤过，获得的上清液即得到粗榧叶总黄酮的提取液。精密量取0.5 mL 滤液置于25 mL 量瓶中，按2.1 项下方法，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 显色法，于510 nm处测定吸光度，并计算粗榧叶总黄酮的得率。

式中，C为根据2.1项下获得回归方程计算的提取液中总黄酮的质量浓度（mg·mL-1），V为提取液定容后的最终体积（mL），n为稀释倍数，m为粗榧叶样品的质量（g）。

2.3 超声提取工艺优化

2.3.1 单因素试验

2.3.1.1 乙醇体积分数对粗榧叶总黄酮得率的影响 固定超声时间40 min，液料比为30∶1，考察不同乙醇体积分数（40%、50%、60%、70%、80%）对粗榧叶总黄酮得率的影响，结果见图1。随着乙醇体积分数的增加，粗榧叶总黄酮得率呈先升高后缓慢下降的趋势，当乙醇体积分数为60%时，总黄酮得率最高。这可能是因为乙醇体积分数为60%时，提取溶剂极性与粗榧叶中总黄酮相似，有利于总黄酮的溶出，乙醇体积分数超过60%时，醇溶性杂质溶出增加，影响黄酮的溶出。故选择乙醇体积分数60%作为后续总黄酮提取工艺优化的参数。

图1 乙醇体积分数对粗榧叶总黄酮得率的影响（±s,n=3）

2.3.1.2 超声时间对粗榧叶总黄酮得率的影响 固定乙醇体积分数60%，液料比为30∶1，考察不同超声时间（20、30、40、50、60 min）对粗榧叶总黄酮得率的影响，结果见图2。随着超声时间的延长，粗榧叶总黄酮得率呈现先升高后缓慢下降的趋势，当超声时间为40 min 时，总黄酮得率最高。这可能是因为超声时间短，黄酮没有完全溶出。超声时间为40 min 时，黄酮基本完全溶出，提取率最高。故选择超声时间40 min 作为后续总黄酮提取工艺优化的参数。

图2 超声时间对粗榧叶总黄酮得率的影响（±s,n=3）

2.3.1.3 液料比对粗榧叶总黄酮得率的影响 固定乙醇体积分数60%，超声时间40 min，考察不同液料比为（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1）对粗榧叶总黄酮得率的影响，结果见图3。液料比增加，粗榧叶总黄酮得率呈现先升高后下降的趋势，当液料比为30∶1 时,总黄酮得率最高。这可能是因为液料比较高时，粗榧叶中黄酮与溶剂接触不完全，随着液料比的降低，黄酮溶出速度加快，当液料比为30∶1 时，黄酮的溶出达到饱和，提取率达到最大；液料比超过30∶1 时，增加了杂质的溶出，不利于总黄酮的提取。故液料比30∶1 作为后续总黄酮提取工艺优化的参数。

图3 液料比对粗榧叶总黄酮得率的影响（±s,n=3）

2.3.2 Box-Behnken 效应面法优化方案设计 依据单因素试验的结果，以粗榧叶总黄酮得率为响应值，乙醇体积分数（A）、超声时间（B）、液料比（C）为自变量，利用Design-Expert 软件进行Box-Behnken设计，对粗榧叶总黄酮提取工艺进行优化。试验因素与水平见表1，结果见表2。

表1 Box-Behnken响应面法优化粗榧叶总黄酮提取的因素与水平

表2 Box-Behnken响应面法优化粗榧叶总黄酮提取的试验设计

2.3.3 回归方程的建立及显著性分析 根据Box-Behnken 效应面法试验结果，利用Design-Expert 8.0.6 软件对表2中的数据进行多元二次回归，得到二次多项回归方程：Y=7.336+0.425A+0.343 75B+0.351 25C+0.202 5AB-0.167 5AC-0.235BC-0.868A2-0.590 5B2-0.135 5C2，该模型的决定系数R2=0.978 4，调整系数R2Adj=0.950 6，表明该方程具有较好的预测性；变异系数=2.55%，说明该模型的重现性较好，可用于分析和预测粗榧叶总黄酮的得率。回归模型方差分析见表3。

由表3可知，二次回归模型的F=35.210 15，P＜0.01，表明回归方程模型差异高度显著，有统计学意义；失拟项P=0.089 799＞0.05，表明该试验不存在失拟因素，所选的因素合理。根据P值大小可知，

表3 Box-Behnken响应面法优化粗榧叶总黄酮提取的回归模型的方差分析

A、B、C、A2、B2对粗榧叶总黄酮得率影响差异有统计学意义（P＜0.01），AB、BC 对粗榧叶总黄酮得率的影响稍弱（P＜0.05），AC、C2的影响差异无统计学意义。从P值大小可知，三因素对粗榧叶总黄酮提取结果的影响顺序为A＞B＞C。

2.3.4 响应面分析 交互因素的响应面图见图4，响应面图的最高点就是交互因素的最佳条件[14]。从图4 可知，乙醇体积分数与超声时间、超声时间与液料比的交互因素中的等高线坡度较陡峭，乙醇体积分数与液料比交互因素的等高线坡度较平缓，说明乙醇体积分数与超声时间、超声时间与液料比的交互作用对粗榧叶总黄酮的得率影响较大，乙醇体积分数与液料比交互因素对粗榧叶总黄酮的得率影响不显著，与回归分析的结果一致，进一步表明所建立的模型较准确。

图4 各因素的交互作用对粗榧叶总黄酮得率影响的响应面图

2.3.5 最佳提取工艺和预测结果验证 由拟合的响应面形状和已建立的回归模型得到粗榧叶总黄酮的最佳提取工艺：乙醇体积分数61.92%，超声时间41.76 min，液料比37.11∶1，此条件下粗榧叶总黄酮的预测提取率为7.56%。为使试验便于操作，将最佳提取工艺修正为乙醇体积分数62%，超声时间42 min，液料比37∶1。按照修正后的最佳提取工艺验证实验，粗榧叶总黄酮得率为（7.51±0.13）%，接近预测值，表明用Box-Behnken响应面法所建立的模型可靠，可用于粗榧叶总黄酮提取条件的优化和结果预测。

2.4 抗氧化活性的测定

2.4.1 DPPH 自由基清除能力的测定 清除DPPH自由基的试验参照申梦娜等[15]的方法，并做如下修改：2 mL 现配的DPPH 溶液分别与2 mL 的不同质量浓度的粗榧叶总黄酮提取液进行混合，于室温下避光保存30 min，在516 nm 波长下测定吸光度。以VC为阳性对照，按公式（2）计算DPPH自由基清除率。

式中，A0为DPPH溶液与无水乙醇混合液的吸光度；A1为不同浓度的粗榧叶总黄酮提取液与DPPH混合液的吸光度；A2为不同浓度的粗榧叶总黄酮提取液与无水乙醇混合液的吸光度；C为DPPH 自由基清除率。

2.4.2 ABTS 自由基清除率测定 参照何珊等[16]的方法，用无水乙醇配置ABTS 溶液，使其在734 nm波长处的吸光度为（0.70±0.02），将粗榧叶总黄酮提取液用无水乙醇稀释成不同浓度的样品溶液，以VC作为阳性对照。分别取2 mL 不同浓度的样品溶液、2 mL 的VC溶液与2 mL ABTS 溶液混合，室温避光反应10 min，用紫外-可见分光光度仪于734 nm 波长处测定粗榧叶总黄酮的吸光度，按公式（3）计算。

式中，A0为ABTS溶液与无水乙醇混合液的吸光度；A1为不同质量浓度的粗榧叶总黄酮提取液与ABTS 混合液的吸光度；A2为不同质量浓度的粗榧叶总黄酮提取液与无水乙醇混合液的吸光度；I为ABTS清除率。

粗榧叶总黄酮提取液抗氧化活性结果见图5。DPPH 自由基清除实验表明，粗榧叶总黄酮质量浓度为40 μg·mL-1时，清除率达到平衡，粗榧叶总黄酮的半数抑制浓度（IC50，7.835 μg·mL-1）低于VC的IC50（13.574 μg·mL-1）。ABTS+自由基的清除实验表明，粗榧叶总黄酮质量浓度为30 μg·mL-1时，清除率达到平衡，粗榧叶总黄酮的IC50（10.551 μg·mL-1）亦低于VC的IC50（16.919 μg·mL-1）。随着粗榧叶总黄酮提取液质量浓度的增加，清除能力都呈现增加的趋势，并具有明显的浓度依赖性，且清除效果优于阳性对照药VC。表明粗榧叶总黄酮提取液具有较好的抗氧化活性。

图5 粗榧叶总黄酮提取液抗氧化活性

3 结论与讨论

本研究以总黄酮得率为响应值，选用Box-Behnken 效应面法从乙醇体积分数、超声时间、液料比等方面对粗榧叶总黄酮的提取工艺进行优化，并采用紫外-可见分光光度法对得到的黄酮进行测定，最终得到最佳提取工艺为乙醇体积分数62%，超声时间42 min，液料比37∶1，粗榧叶总黄酮得率为（7.51±0.13）%，优于刘晓娇等[11]通过正交设计优化后的工艺获得的粗榧叶总黄酮（5.91%），且该方法直观性和与预测性均优于正交设计。

体外抗氧化活性试验表明，最佳提取条件下得到的粗榧叶总黄酮提取液对DPPH 自由基的清除率稍高于报道，且本研究新增了粗榧叶总黄酮提取液对ABTS 自由基清除率的测定。DPPH 自由基及ABTS 自由基的清除率试验结果均表明，粗榧叶总黄酮提取液具有较强的抗氧化活性，为天然抗氧化剂的开发提供了新思路，值得进一步的研究开发。