利惠婵 黄玉林

结核病是严重影响人类健康的传染病之一,虽然近年来已经得到了有效的控制,但是目前依旧是全球性的重大公共卫生问题之一。有数据显示,结核病的患病人数居于世界第二位,及时进行病原学检查是有效发现传染源,对其进行诊断和治疗的关键［1］。目前,临床上对肺结核患者进行诊断时,主要有涂片染色法和罗氏培养法,涂片染色法虽然操作简单,但是其检验结果的阳性率较低,临床上主要以改良罗氏培养法作为金标准对结核病患者进行诊断,但是其检测周期比较长,对其临床应用造成了限制。近年来,随着分子生物科技技术的发展,FQ-PCR技术被广泛的应用在了对肺结核患者的诊断中,此种诊断方式对结核杆菌的敏感性和特异性较高,并且所用的时间比较短,得到了广大学者的认可［2］。本次研究选取了92例2018年7月～2019年12月在本院治疗的疑似肺结核患者,通过对其实施抗酸杆菌检测、结核杆菌培养、FQ-PCR技术检测,详细的分析了FQ-PCR技术检测结核杆菌的临床应用价值。具体如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年7月～2019年12月在本院治疗的92例疑似肺结核患者,采集其痰液(61例)、胸腹水(14例)、脑脊液(17例)标本,将标本采集后立即送检,或者保存在4℃的环境中,但是注意保存时间<5 d。所有检测操作都在Ⅱ级生物柜中进行。本次研究及时上报了本院伦理委员会,并经过了批准。

1.2方法 对采集到的标本均进行抗酸杆菌检测、结核杆菌培养和FQ-PCR技术检测。

1.2.1抗酸杆菌检测 各项操作严格按照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》中的相关要求进行。

1.2.2结核杆菌培养 取浓度为4%的氢氧化钠溶液,采用无菌操作的手法将标本接种于改良罗氏培养基的斜面上,在37℃的环境下分别进行为期3 d和7 d的培养,对培养结果进行详细的观察。之后每周对标本的生长情况进行观察,一直到阳性结果出现,或者当60 d后无生长则评判为培养阴性。如果发现培养基上出现明显的菌落,则立即进行抗酸染色涂片,即确认是抗酸杆菌,然后进行生化实验,对菌种及药敏情况进行鉴定,对阳性标本的培养标准参考《结核病细菌学检验规程》中的相关要求,采用对硝基苯甲酸(PNB)培养基生长试验对培养基中的菌种进行鉴定。

1.2.3FQ-PCR技术检测 在采集到的标本中加入标本体积4倍的浓度为4%的氢氧化钠溶液,液化30 min,采用吸管取0.5 ml置于离心管中,再加入同等体积的浓度为4%的氢氧化钠溶液,10 min后置于本院全自动离心仪上进行离心处理,将离心仪的转速调整为3000 r/min,离心5 min,倒出上层清液,在沉淀物中加入1 ml无菌生理盐水充分的摇匀,再次置于全自动离心仪上进行离心处理,将离心仪的转速调整为3000 r/min,离心5 min,倒出上层清液,重复洗涤1次。取50 μl DNA加入沉淀物中,置于沸水中10 min,将其转至4℃的环境下放置6～8 h,保证DNA的充分裂解。置于全自动离心仪上再次进行离心,将离心仪的转速调整为2000 r/min,离心5 min,取上层清液20 μl进行PCR反应。在93℃的环境下进行预变性2 min、93℃45 s、55℃ 60 s,扩增10个循环后,再次行93℃ 30 s、55℃ 45 s,扩增30个循环,再分别取50 μl阴性质控品和阳性质控品,分别加入等量的DNA提取液,将其混合均匀后行沸水浴,之后的处理方式与上述相同。对本次结果的判定依照检测试剂说明书进行。

1.3观察指标 比较三种检测方式的检测结果。

1.4统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件进行统计分析。计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

92例疑似肺结核患者中,经病理组织学检验结果显示82例(89.13%)为阳性,10例(10.87%)为阴性。以结核杆菌阳性检出率为评价指标,FQ-PCR技术检测阳性率为75.00%(69/92),抗酸杆菌检测阳性率为56.52%(52/92),结核杆菌培养检测阳性率为70.65%(65/92)。FQ-PCR技术检测及结核杆菌培养检测的阳性率均高于抗酸杆菌检测,差异具有统计学意义 (χ2=6.976、3.967,P<0.05)；FQ-PCR技术检测与结核杆菌培养检测的阳性率比较,差异无统计学意义(χ2=0.439,P>0.05)。见表1。

表1 三种检测方式的检测结果(n)

3 讨论

结核病属于临床常见疾病,由于该病具有传染性,因此目前世界范围内已经将结核病作为全球严重公共卫生问题。目前,在结核病发病率方面,世界卫生组织估计,全球感染结核分枝杆菌的人口数量占全球人口的1/3,且每年因结核病死亡的患者达到300万人,每年新生结核病患者800～1000万人。所以,对结核病患者需积极预防与治疗,这就要求临床中对结核病加强诊断,尽早明确患者病情,便于及时进行治疗。

在结核分枝杆菌检测中,目前临床中主要采用改良罗氏培养法、痰涂片法、BacTALERT3D及BacTECTB960分枝杆菌快速培养方法等。在大多数结核病高发国家,对其进行诊断时依旧以直接涂片检查法对抗酸杆菌进行检测,这也是最符合成本效益的方式之一,不但操作简便,并且用时较短,一般几个小时内就能得到检测结果,但是其对抗酸杆菌的敏感性比较低,一般需要5000～10000条菌/ml以上浓度的抗酸杆菌标本才能检出,而对于菌量较少的肺结核和肺外结核患者,其敏感度更低,由于在检测的过程中,重要对阳性抗酸杆菌进行检测［3］。因此,对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行区分时也就显得比较困难,加上其会导致机体出现不同的疾病,临床治疗方式也存在着明显的差异,极易导致误诊、错误用药的风险,对死菌和活菌的区分也就更加困难［4］。临床上将结核杆菌培养法作为结核病诊断的金标准,其对抗酸杆菌的敏感性比较高,其虽然能够对活菌和死菌进行判断,但是所用的时间比较长,一般2～8周才能得到检测结果［5］。随着PCR技术的出现,Hance等［6］在其研究中,于1989年首先在结核分枝杆菌检测中应用PCR技术,开辟了以PCR为代表的分子生物学技术在结核分枝杆菌检测中应用的时代。该技术在实际应用中的检测灵敏度比较高,在1～100 fg纯化结核分枝杆菌DNA检测中表现出较高的特异性。但常规PCR技术在应用中因扩增产物污染,存在不能定量的问题及假阳性的问题,检测结果准确性受到影响,这也为后来FQ-PCR技术的出现提供了基础。

FQ-PCR检测法是一种新型的核酸定量检测技术,其在常规PCR的基础上加入了荧光标记探针,通过荧光信号的积累对核酸量进行测定,如检测结果显示为阳性,则也进一步提示标本中含有结核分枝杆菌DNA。荧光定量原理：多数Tap酶有5’-3’DNA聚合酶活性,在引物引导作用下,其DNA链能够延伸；同时Tap酶中还有5’-3’外切酶活性,在DNA链延伸的过程中,对链能够替换,并切断被替换掉的单链。而荧光定量即是对Tap酶中两种酶活性的充分利用发展起来的检测技术。此种检测方式是在全封闭的状态下进行了PCR的扩增,并对扩增产物进行了检测,但是不需要扩增后再进行开盖处理,从而有效的避免了扩增产物受到污染从而引发假阳性检测结果的出现［7］。此种检测技术在对抗酸杆菌检测的过程中,对抗酸杆菌的敏感度比较高,能够对1～20个结核分枝杆菌菌体的DNA量进行检测,其检测特异性较高,重复性较强,其检测结果明显优于常规PCR的检测结果。一般情况下,只需要2～3 h就能得到检测结果,尤其是对生长比较缓慢的细菌或者培养比较困难的微生物,应将FQ-PCR检测法作为首选。

本次研究中采用了阳性和阴性对检测结果进行了表示,实际上,FQ-PCR检测法能够进行定量检测,其阳性上限和下限分别为109 copies/ml和80 copies/ml,定量检测结果给临床治疗及预后评估均起到了积极的意义。因此,临床上也可将FQ-PCR检测结果作为对结核病患者诊断的主要指标和临床筛选指标,为结核病的快速诊断提供了有力的指导依据。极大的缩短了患者等待的时间,保证了临床治疗的有效性。本次研究结果显示,FQ-PCR技术检测及结核杆菌培养检测的阳性率均高于抗酸杆菌检测,差异具有统计学意义 (P<0.05)；FQ-PCR技术检测与结核杆菌培养检测的阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。这一结论对肺外标本的检测也有着极高的价值,进一步提示FQ-PCR技术能够有效检测痰液、胸腹水、脑脊液等标本中的特异基因片段,结核杆菌培养检测和抗酸杆菌检测则不能对标本中的特异基因片段进行检测。在实际应用中,PQ-PCR技术在结核杆菌检测中对TB-DNA原始拷贝可准确定量,为PCR技术发展提供了新的前景,为肺结核快速诊断提供了依据。但目前在临床研究中,由于研究对象数量不足,研究结果可能存在偏差,因此在后续研究中还需扩大样本量,使研究结果更细致、准确。

综上所述,临床上对结核杆菌进行检测时,依旧以结核杆菌培养检测为诊断金标准,为临床用药、耐药性检测等提供了准确的指导依据,也是抗酸杆菌检测和FQ-PCR技术检测所无法替代的,但是其耗时较长,因此,还需对其进行改进。采用FQ-PCR技术检测,虽然偶尔也会出现假阳性和假阴性结果,但是其检测过程简便快捷,并且准确率较高,临床诊断人员也可将FQ-PCR技术与结核杆菌培养检测、抗酸杆菌检测等进行联合起来使用,在提高诊断准确率的同时,为肺结核疾病的诊断和治疗提供准确的指导依据。