石会玲，周宇航，何 平，黄蒙蒙，邵 帅，葛菁萍，凌宏志

（1黑龙江大学生命科学学院微生物重点实验室，哈尔滨 150080；2黑龙江大学农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨 150500）

0 引言

乙偶姻(AC)又称3-羟基丁酮或甲基乙酰甲醇[1]，具有特殊的奶油香味，自然存在于干酪、香蕉、可可、玉米、葡萄、苹果和肉类等食品中[2-3]，乙偶姻的应用范围极其广泛，为满足社会的需求，目前有大量的学者对于乙偶姻的生产方法及产量进行研究[4-5]。微生物以糖类物质为底物发酵生产乙偶姻是比较典型的发酵途径，葡萄糖通过磷酸转移酶系统(PTS)被细胞利用，其中除部分碳源供菌体生长以外，还会形成一系列的中间代谢产物和副产物，如乳酸、乙酸、丁二酸、乙醇、2,3-丁二醇和乙偶姻等[6-7]。在发酵过程中，这些副产物的产生不仅消耗了代谢过程中产生的能量，而且对乙偶姻的产量积累产生不利的影响，增加了下游工程中乙偶姻分离纯化的难度[8-11]。因此，对乙偶姻代谢支路副产物的相关关键酶基因敲除成为基因工程改造提高乙偶姻产量的主要策略之一[12-16]。

自杀质粒同源重组技术是将构建好的自杀敲除质粒，通过细菌接合的方法进入到受体菌中[17]。将扩增的外源的目的基因同源重组片段插入到自杀质粒当中，利用自杀质粒可以在供体菌中复制，但不可以在受体菌中复制特点，通过细菌接合的方式使自杀质粒进入到受体菌中[18]。在重组酶的作用下，使自杀质粒上的线性打靶片段与染色体的特定目的基因序列发生同源重组，目的基因被置换下来，然后利用自杀质粒上的抗生素筛选标记筛选单交换阳性转化子[19-20]。……