杨隆良，郭虎林，马瑜

作者单位：1青海省第五人民医院，a普外科，b肿瘤内科，青海 西宁810000；2青海大学附属医院肝胆外科，青海 西宁810000

胆囊癌是胆道系统常见的恶性肿瘤，是消化道第6大恶性肿瘤，其恶性程度高，病人预后差，5年生存期低于5%。研究其抑制靶点有助于延长病人生存期。

研究表明，与癌旁组织相比，在胆囊癌组织中有许多长链非编码RNA（lncRNA）明显上调或下调，在肿瘤进展、转移等方面发挥重要作用。lncRNA Rpph1在多种癌症中表达异常，参与癌细胞的增殖、转移等。但是lncRNA Rpph1在胆囊癌中的表达和作用尚不清楚。本研究于2019年4—10月检测胆囊癌细胞系GBC-SD、SGC-996和NOZ中lncRNA Rpph1的表达，探讨慢病毒介导沉默lncRNA Rpph1对胆囊癌细胞周期、增殖和凋亡的作用及潜在机制。以期为胆囊癌的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

人胆囊上皮细胞HGBEC及胆囊癌细胞系NOZ购自日本健康科学研究资源库，SGC-996和GBC-SD购自中科院上海细胞库；DMEM高糖培养基、RPMI-1640培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司，胰蛋白酶购自美国Sigma-Aldrich公司；细胞计数试剂盒（CCK-8）和细胞周期、凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，引物、lncRNA Rpph1慢病毒沉默载体（si-lnc Rpph1）和对照si-con购自上海吉玛制药有限公司；miR-384抗体、周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）抗体、Ki-67抗体、剪切型胱天蛋白酶3（Cleaved caspase-3）抗体、剪切型胱天蛋白 酶9（Cleaved caspase-9）抗 体、β连 环 素（βcatenin）抗体、c-Myc抗体、β肌动蛋白（β-actin）抗体购自美国Santa cruz公司；慢病毒转染试剂、RNA提取试剂Trizol、real-time PCR试剂盒、逆转录试剂盒（RT-PCR）购自美国Invitrogen公司；流式细胞仪购自美国BD公司，Real-time PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1

细胞培养在DMEM高糖培养液中培养人胆囊上皮细胞HGBEC、胆囊癌SGC-996和NOZ细胞，在RPMI-1640培养液中培养胆囊癌细胞GBCSD，培养液中均含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素，培养条件：在湿度95%，37℃5%二氧化碳培养箱中培养细胞，消化传代。

1.2.2

慢病毒感染和细胞转染用培养液稀释对数生长期的GBC-SD细胞，将细胞以2×l0个/孔接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到50%时，按照慢病毒感染说明书进行GBC-SD细胞感染，用阴性对照慢病毒si-con和携带si-lnc Rpph1的慢病毒感染GBC-SD细胞，分别为对照si-con组和si-lnc Rpph1组，感染24 h更换培养基，观察细胞状态并检测细胞中lncRNA Rpph1含量，对慢病毒干扰效果进行验证，干扰成功后进行后续实验。

1.2.3

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）检测lncRNA Rpph1的表达用Trizol试剂提取HGBEC、GBC-SD、SGC-996和NOZ细胞总RNA，然后逆转录合成互补DNA（cDNA）并检测，然后以cDNA为模板，按照real-time PCR试剂盒的说明书进行反应，合成lncRNA Rpph1。lncRNA Rpph1正向引物5’-CAGACTGGGCAGGAGAAGCC-3’，反向引物5’-TCACCTCAGCCATTGAACTCG-3’。运用2方法进行数据分析。

1.2.4

CCK-8实验测定细胞增殖将转染后的GBC-SD培养至对数生长期，胰酶消化细胞，培养基重悬并稀释细胞，以浓度2×10个/孔（200 μL细胞）接种于96孔板，NC组加入未转染的GBC-SD细胞，在培养至24 h、48 h、72 h时，加入20 μL CCK-8溶液，培养2 h，酶标仪检测450 nm处的吸光度。

1.2.5

流式细胞术检测细胞周期和凋亡率将转染后的GBC-SD培养至对数生长期，消化细胞，收集细胞，清洗细胞，用70%冷乙醇固定细胞4℃过夜，离心收集细胞，加入500 μL配制好的碘化丙啶染色液，避光37℃孵育30 min，然后上流式细胞仪检测488 nm波长处红色荧光，计算各组G0～G1期、S期、G2～M期细胞百分比。根据凋亡试剂盒说明书检测细胞凋亡率。

1.2.6

蛋白质印迹法收集慢病毒转染的GBC-SD细胞，裂解破碎细胞，收集蛋白，检测蛋白浓度。将蛋白样本进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入一抗，CDK2抗体（1∶3 000）、Ki-67抗体（1∶2 000）、Cleaved caspase-3抗体（1∶1 000）、Cleaved caspase-9抗 体（1∶1 000）、βcatenin抗体（1∶2 000）、c-Myc抗体（1∶1 000）和抗βactin抗体（1∶2 000），4℃孵育过夜。洗膜3次，然后加入稀释的辣根过氧化物酶标二抗，室温孵育2 h。以β-actin为内参，分析蛋白水平。

2 结果

2.1 lncRNA Rpph1在人肝囊上皮细胞和胆囊癌细胞系中的表达

HGBEC组、胆囊癌细胞系GBCSD、SGC-996和NOZ组细胞中lncRNA Rpph1含量分别为（1.07±0.13）、（4.89±0.31）、（3.42±0.42）、（3.96±

0.45

），

F

=195.965，

P

＜0.001。与HGBEC组相比，其余三组lncRNA Rpph1含量显著升高（

P

＜0.05）；lncRNA Rpph1在胆囊癌细胞系GBC-SD、SGC-996和NOZ中表达情况一致（

P

＞0.05），采用GBC-SD进行后续实验。

2.2 沉默lncRNA Rpph1抑制胆囊癌GBC

-

SD细胞增殖

与si-con组相比，si-lnc Rpph1组的GBC-SD细胞中lncRNA Rpph1表达量降低，细胞活性在24 h、48 h和72 h均显著降低（

P

＜0.05），见表1。

表1 沉默长链非编码RNA（lncRNA）Rpph1抑制胆囊癌GBC-SD细胞活性/±s

2.3 沉默lncRNA Rpph1诱导胆囊癌GBC

-

SD细胞周期阻滞

与si-con组相比，si-lnc Rpph1组的GBC-SD细胞中CDK2和Ki-67蛋白含量降低，G0～G1期细胞百分比显著升高，S期细胞百分比显著降低（

P

＜0.05），见图1和表2。

图1 沉默长链非编码RNA（lncRNA）Rpph1表达对胆囊癌GBC-SD细胞CDK2和Ki-67蛋白表达的影响

表2 沉默长链非编码RNA（lncRNA）Rpph1对胆囊癌GBC-SD细胞细胞周期及对CDK2、Ki-67蛋白表达的影响/±s

2.4 沉默lncRNA Rpph1促进胆囊癌GBC

-

SD细胞凋亡

与si-con组相比，si-lnc Rpph1组的GBC-SD细胞中凋亡蛋白Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白含量均显著升高，细胞凋亡率升高（

P

＜0.05），见图2和表3。

表3 沉默长链非编码RNA（lncRNA）Rpph1诱导胆囊癌GBC-SD细胞凋亡/±s

图2 沉默长链非编码RNA（lncRNA）Rpph1对胆囊癌GBC-SD细胞中Cleaved caspase-9、Cleaved caspase-3表达的影响

2.5 沉默lncRNA Rpph1对胆囊癌GBC

-

SD细胞中Wnt/

β-

catenin信号通路的影响

与si-con组相比，si-lnc Rpph1组的GBC-SD细胞中β-catenin和c-Myc蛋白表达量显著降低（

P

＜0.05），见图3和表4。

表4 沉默长链非编码RNA（lncRNA）Rpph1对胆囊癌GBCSD细胞中Wnt/β-catenin信号通路的影响/±s

图3 沉默长链非编码RNA（lncRNA）Rpph1胆囊癌GBC-SD细胞中β-catenin和c-Myc蛋白表达的影响

3 讨论

研究表明，多种lncRNAs在胆囊癌肿瘤进展、侵袭和转移等方面均发挥重要作用。lncRNA Rpph1已被证实参与实体瘤、糖尿病肾病和神经退行性疾病的进展。结直肠癌组织中lncRNA Rpph1显著上调，lncRNA RPPH1在体内外均可促进结直肠癌的转移，并且lncRNA RPPH1过度表达与晚期TNM分期和不良预后相关。lncRNA Rpph1在乳腺癌细胞中也表达上调，其过表达可靶向miR-122促进乳腺癌细胞周期、增殖和克隆形成，且慢病毒介导的lncRNA RPPH1干扰抑制裸鼠的肿瘤生长。lncRNA Rpph1高表达预示急性髓系白血病病人总体生存率较低，慢病毒介导敲除lncRNA Rpph抑制了人急性髓系白血病细胞的增殖、侵袭和迁移能力，显著抑制THP-1裸鼠移植瘤的生长。本研究发现，与HGBEC相比，lncRNA Rpph1在胆囊癌细胞系GBC-SD、SGC-996和NOZ中含量均显著升高，与上述研究结果类似。本研究采用慢病毒感染胆囊癌GBC-SD细胞沉默lncRNA Rpph1以研究其对胆囊癌的作用，结果表明，沉默lncRNA Rpph1可抑制胆囊癌GBC-SD细胞增殖活性，诱导细胞周期停滞在G0～G1期，提高细胞凋亡率，降低CDK2和Ki-67蛋白含量，提高Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9含量。说明lncRNA Rpph1在胆囊癌发展中发挥重要作用，慢病毒介导的lncRNA RPPH1沉默可抑制胆囊癌细胞增殖，促进细胞凋亡，具体分子机制尚不清楚。

Wnt/β-catenin作为细胞内重要的信号通路，其在细胞增殖、分化、凋亡以及细胞癌变、肿瘤侵袭转移等生理病理过程中均发挥了重要的调控作用。研究显示胆囊癌样本中Wnt/β-catenin异常激活，抗癌药曲美替尼通过降低β-catenin的表达或抑制β-catenin的核转运来阻断Wnt/β-catenin信号传导进而抑制胆囊癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。还有研究表明，lncRNA Rpph1在β-淀粉样蛋白致阿尔茨海默病体外细胞模型中过表达，lncRNA Rpph1激活Wnt/β-catenin信号通路，通过直接靶向miR-122改善β-淀粉样蛋白诱导的神经元凋亡。本研究检测发现，慢病毒介导沉默lncRNA Rpph1可使胆囊癌GBC-SD细胞中Wnt/β-catenin信号通路蛋白βcatenin和c-Myc含量均降低，说明沉默lncRNA Rpph1可抑制Wnt/β-catenin信号通路。

综上所述，本研究阐述了lncRNA Rpph1在胆囊癌细胞系GBC-SD、SGC-996和NOZ中均上调。在胆囊癌GBC-SD细胞中，慢病毒介导沉默lncRNA Rpph1可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路诱导胆囊癌细胞周期停滞，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。lncRNA Rpph1可能是胆囊癌的潜在分子靶点。

本研究不足之处，只针对一种胆囊癌细胞进行了实验，还需对多种细胞进行实验或动物体内实验，以确认慢病毒介导沉默lncRNA Rpph1对胆囊癌的抑制作用。