神经突起导向因子-1蛋白在结直肠癌组织中的表达与临床病理特征及预后的关系

2021-09-02曾群章韩琳薛吓娟方艺聪

安徽医药 2021年9期

曾群章，韩琳，薛吓娟，方艺聪

作者单位：福建省漳州市医院，a结直肠肛门外科，b消化内科，福建漳州363000

结直肠癌是我国第三大常见癌症，其发病率和病死率持续上升。尽管随着治疗策略的改进，结直肠癌病人的5年生存率在过去30年已从22%提高到47%，但总体生存率仍然不够理想。目前，根治性手术是最有效的治疗方法，但是病程早期症状较为隐匿，难以及时诊断与治疗，手术切除率不到20%，是结直肠癌病人预后差的主要原因。已有明确的证据显示，筛查可使结直肠癌的发生率和病死率降低30%～60%。因此，需要更有效的生物标志物预测结直肠癌的预后，并实施分层治疗。

神经突起导向因子-1（netrin-1）在胚胎及神经系统发育中发挥轴突导向功能，促进神经细胞迁移。netrin-1除了表达于神经系统外，还在肺脏、视网膜等多种组织器官中表达，在炎症调节、血管生成、肿瘤进展等方面发挥重要作用。张旭等发现，netrin-1在6种不同来源的结直肠肿瘤细胞中表达上调，尤其以SW620、LOVO、LS174T结直肠癌细胞株最为显著。但是，netrin-1在结直肠癌临床样本中的表达情况尚无报道，因此本研究检测结直肠癌组织及癌旁正常组织中netrin-1的表达情况，分析其与临床病理特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

根据研究目的，以随机数字表法选取2012年1月至2014年6月福建省漳州市医院符合标准的结直肠癌病人共计184例作为研究对象，均行结直肠癌根治术，术中留取癌组织样本，并选取距肿瘤边缘5 cm的癌旁正常组织作为对照。纳入标准：（1）术后标本经病理学诊断证实为结直肠癌；（2）临床病理资料完整；（3）首发肿瘤。排除标准：（1）临床病理特征资料不完整的病人；（2）合并其他肿瘤的病人；（3）术前已接受放化疗或生物治疗的病人。收集临床病理资料，包括性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、浸润深度、分化程度、TNM分期、病理学类型、淋巴结转移。TNM分期参照第7版（2010）结直肠癌美国癌症联合委员会（AJCC）分期标准。所有病人均已签署知情同意书，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 实验方法

1.2.1

主要试剂抗netrin-1抗体购自英国Abcam公司；SP-9000通用SP试剂盒、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒、苏木精、中性树胶购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2

免疫组织化学染色检测netrin-1表达将获得的组织标本用多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片获得4 μm厚的石蜡切片，常规进行脱蜡、水化、抗原修复等步骤，滴加3%的过氧化氢溶液孵育10 min，然后滴加山羊血清封闭液孵育10 min。滴加抗netrin-1抗体（1∶100），4℃过夜孵育。次日洗涤后，采用SP-9000通用SP试剂盒继续染色。DAB显色、苏木精复染、冲洗、脱水、中性树胶封片。

1.2.3

结果判断标准染色结果由2名资深病理医师双盲独立判断，有分歧的病例，由第3位医师综合判断。将胞质中淡黄色、棕黄色或褐色染色作为阳性细胞，然后根据染色指数进行判断，染色指数=染色强度积分×阳性细胞比例积分，染色指数包含8个分值，即0、1、2、4、6、8、9、12分，＞4分作为高表达，≤4分则作为低表达。高倍镜下随机选取5个视野，观察染色强度：未着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，褐色为3分；对阳性细胞与总细胞进行计数，计算比例积分：＜10%为0分，10%～25%为1分，＞25%～50%为2分，＞50%～75%为3分，＞75%为4分。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0进行分析。计数资料比较使用

检验，Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存率比较使用log-rank检验，Cox比例风险回归模型分析预后影响因素。检验水准

=0.05。

2 结果

2.1 netrin

1在结直肠癌组织与癌旁正常组织中的表达情况

免疫组织化学染色结果显示，netrin-1呈淡黄色、棕黄色或褐色表达于胞质，在癌组织中大部分为高表达，而在癌旁正常组织则不表达或低表达。癌组织与癌旁正常组织中netrin-1高表达率分别为71.7%（132/184）、9.8%（18/184），差异有统计学意义（

=146.255，

＜0.001）。

2.2 netrin

1表达与临床病理特征的相关性

netrin-1高表达与浸润深度（

=0.001）、TNM分期（

0.003

）、淋巴结转移（

＜0.001）有关，而与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、分化程度、病理学类型无关（

＞0.05），见表1。

表1 神经突起导向因子-1（netrin-1）表达与结直肠癌184例临床病理特征的相关性/例

2.3 netrin

1表达对病人生存率的影响

netrin-1高表达病人失访4例，低表达病人失访2例，随访率为96.7%。netrin-1高表达与低表达者5年总生存率分别为40.9%（54/132）和71.2%（37/52），差异有统计学意义（

=15.101，

＜0.001）。见图1。

图1 神经突起导向因子-1（netrin-1）表达水平与结直肠癌184例总生存率的关系

2.4 5年总生存率的单因素与多因素分析

对结直肠癌病人5年总生存率与各临床病理特征的关系进行分析，单因素分析结果显示浸润深度（

=0.027）、TNM分期（

=0.002）、淋巴结转移（

＜0.001）、netrin-1表达（

＜0.001）与结直肠癌病人5年总生存率相关（见表2）；将该4种因素纳入Cox比例风险回归模型进行多因素分析，结果显示TNM分期（

=1.768，

0.023

）、淋巴结转移（

=1.946，

=0.008）、netrin-1表达（

=1.959，

=0.039）是结直肠癌病人的独立预后因素（见表3）。

表2 结直肠癌184例5年总生存率的单因素分析

表3 结直肠癌184例5年总生存率的Cox多因素分析

3 讨论

Netrin-1是一种多功能的分泌糖蛋白，在神经发育、血管生成等过程中发挥关键作用，因此Ne-trin-1与多种疾病密切相关，包括糖尿病、动脉粥样硬化、癌症等。多项研究证实，netrin-1在部分癌症中表达上调，可阻止其依赖受体结直肠癌缺失蛋白（DCC）和UNC5同源蛋白（UNC5H）诱导的细胞凋亡，如Harter等报道，netrin-1在脑转移瘤中高表达是病人生存不良的独立预后因素。因此，对血液或尿液中的netrin-1含量进行检测已被提议作为癌症的预测指标，其与其受体相互作用的抑制药物也已开始研发，一种人源化的抗netrin-1抗体，也被称为NP137，目前处于I期临床试验中。尽管如此，netrin-1在结直肠癌组织中的表达情况及与临床病理特征及预后的关系尚不清楚。

本研究通过对癌组织及癌旁正常组织进行免疫组织化学染色发现，netrin-1主要表达于细胞质，在癌组织中大部分为高表达，而在癌旁正常组织则不表达或低表达，癌组织中netrin-1高表达率为71.7%（132/184），显著高于癌旁正常组织9.8%（18/184）。该结果与张旭等在结直肠癌细胞株中发现其表达上调的趋势一致，提示其高表达可能参与结直肠癌的发生发展。进一步分析netrin-1表达与各临床病理特征的相关性发现，肿瘤的浸润深度越深、TNM分期越晚、伴有淋巴结转移者，netrin-1表达水平越高，表明netrin-1参与结直肠癌细胞的增殖与转移，但是具体机制仍不清楚。Barallobre等认为，netrin-1可与DCC受体相结合，使其同源二聚体化，从而将caspase-3的剪切位点封闭，抑制该信号通路介导的细胞凋亡。此外，netrin-1还可能通过活化PI3K/AKT信号通路促进人肺腺癌A549细胞与PC9细胞发生上皮间质转化；netrin-1可与neogenin（neonatal protein，再生蛋白）相互作用，增强CD4T细胞的趋化作用，并引发促炎症反应，在肿瘤微环境的调节中发挥关键作用；netrin-1可以促进血管内皮细胞与平滑肌细胞增生、迁移与黏附，其促血管生成效应可能是肿瘤生长的必要条件。

本研究对病人进行随访发现，netrin-1高表达者的5年总生存率为40.9%（54/132）显著低于低表达者71.2%（37/52）。预后单因素分析结果显示，浸润深度、TNM分期、淋巴结转移、netrin-1表达与结直肠癌病人5年总生存率相关。将这4种有统计学意义的因素纳入Cox多因素分析，结果表明TNM分期、淋巴结转移、netrin-1表达是结直肠癌病人的独立预后因素。因此，netrin-1表达有可能成为结直肠癌病人预后评价的生物学指标，也为机制研究与药物开发提供了一个新的作用靶点。

本研究的不足与展望：（1）netrin-1的依赖性受体DCC与UNC5C也在多种肿瘤中异常表达，与肿瘤病人预后密切相关，但是本研究未对netrin-1的受体进行检测，未来需要进一步探讨其受体的表达情况及与临床病理特征、预后的关系；（2）本研究通过对临床组织进行病理染色分析netrin-1的表达情况，但是有研究发现，netrin-1在肿瘤病人的血浆中也存在差异性表达，而血浆较组织样本病理检测具有取材简单便捷等优势，对于早期诊断具有更重要的临床意义，因此后续仍需要从血浆表达的角度进一步完善本研究结论；（3）netrin-1促进结直肠癌发生发展的机制仍未探讨，未来需要进一步在体外细胞培养与移植瘤动物模型中深入研究，通过基因敲除、RNA干扰、蛋白阻断等方法揭示netrin-1的上下游调节通路。

综上所述，netrin-1在结直肠癌组织中表达升高，其高表达可能参与结直肠癌的发生发展，对预后判断有一定的参考价值。