申海艳 周静 肖丽娜 马武开 姚血明 陈琳 韩珊

(1贵州省骨科医院骨外科，贵州 贵阳 550001；2贵州中医药大学第二附属医院风湿免疫科；3贵州中医药大学)

膝骨关节炎(KOA)是一种因关节软骨损伤、退变而引发的慢性关节病。其症状表现为膝关节肿胀、僵硬、膝关节酸痛及活动受限。老年女性发病率高，中后期可导致关节畸形、甚至废用，使患者生活质量严重下降〔1〕。目前临床治疗KOA主要以缓解症状为主。苗药五藤膏作为贵州中医药大学第二附属医院长期用于治疗KOA的临床外治经验方，课题组前期临床研究已显示可有效缓解老年KOA患者关节疼痛、僵硬等临床症状，治疗KOA疗效确切〔2～5〕。KOA发病机制复杂，有研究认为被激活的Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)参与了骨关节炎的病理过程，其表达水平在Wnt信号通路中发挥了重要作用，Wnt通路的关键蛋白能够显著降低KOA软骨细胞基质金属蛋白酶(MMP)-13、原癌基因(c-myc)等靶基因的表达量〔6〕。由于β-catenin表达能够使下游Wnt基因MMPs、c-myc等异常表达，因此正常水平的β-catenin对软骨细胞发挥正常功能尤为重要。本研究通过建立KOA模型，从细胞及分子水平探讨不同剂量苗药五藤膏干预相应的时间对KOA模型家兔关节软骨β-catenin蛋白及MMP-13、c-myc表达的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 2019年3～6月选取同一批4～5月龄健康家兔96只，体重1.5～2.5 kg，由贵州中医药大学中心实验室提供，遵照实验动物伦理要求。饲养于贵州中医药大学动物实验中心，室温20～25℃，湿度50%～60%，实验动物合格证号：SCXK(黔)2018-0012。

1.2实验药物 苗药五藤膏(黑骨藤30 g、大血藤30 g、小花青风藤30 g、香血藤30 g和络石藤30 g打成细粉与凡士林按1∶1的比例混合制成)，本实验药物为贵州中医药大学第二附属医院院内制剂(黔药制字Z20120072)，由贵州中医药大学第二附属医院制剂室提供。使用前均匀将五藤膏涂于纱布上做成贴膏。氟比洛芬巴布膏，生产厂家：日本三笠制药株式社会，规格：40 mg，批号：J20160090。

1.3主要仪器和试剂 DYCZ-24DN电泳槽(北京六一仪器厂)、HI650离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、MUTISKANMK3酶标仪(Thermo)、QuantStudio6实时荧光定量-聚合酶链式反应(qRT-PCR)仪(ABI)、TS8080灰度扫描仪(Canon)、JY02S超微量紫外分析仪(北京君意东方电泳设备有限公司)；BCA试剂盒(厂家：Beyotime，批号：P0010)、蛋白marker10-250 kD(厂家：海利克思，批号：P12103-2)、兔多抗P-β-catenin(85 kD)(厂家：LSBio，批号：LS-C356001-100)、兔多抗GAPDH(37 kD)(厂家：杭州贤至生物有限公司，批号：AB-P-R 001)、Trizol(厂家：Ambion，批号：15596-026)、DL2000 DNA Marker(厂家：TIANGEN，批号：MD114-02)。

1.4分组与给药

1.4.1动物分组 适应性喂养1 w后，将96只家兔按随机数字表法分为6组，即：①空白组；②模型组；③巴布膏对照组；④五藤膏高量组(约4 g)；⑤五藤膏中量组(约2 g)；⑥五藤膏低量组(约1 g)；每组各16只。

1.4.2构建兔KOA模型 为了尽量减少或避免对家兔膝关节的人为损伤，更好地模拟人KOA的疾病发展，反映中医外治法对兔KOA的治疗作用；采用经典的木瓜蛋白酶关节腔内注射方法制备兔KOA模型〔7〕，将4%的木瓜蛋白酶生理盐水溶液0.3 ml分别于第1、4、7天注入兔右膝关节，第7天注射完毕后，不再进行任何干预(整个造模过程由指导小组成员协助完成)。正常饲养4 w后，通过组织切片观察造模，建立稳定的兔KOA模型。

1.4.3给药方法 从造模后第5周开始干预治疗，空白组不做任何干预，正常饲养。模型组患膝无菌纱布包扎固定，其余各组分别给予氟比洛芬巴布膏贴敷及不同剂量五藤膏贴敷干预；各治疗组家兔药物使用剂量均为人体等效剂量〔8〕，氟比洛芬巴布膏和苗药五藤膏面积约为4 cm×3 cm，氟比洛芬巴布膏(约2 g)，五藤膏高量组(约4 g)、中量组(约2 g)、低量组(约1 g)。将五藤膏均匀涂于纱布上做成贴膏，直接敷贴于兔患膝关节面，药物能覆盖患肢膝关节，用绷带包扎固定8 h防止药物挣脱，1次/d。给药后1、2、3、4 w各处死4只，在右侧膝关节剥除皮肤取软骨进行各项指标检测。

1.5指标检测 Western印迹检测β-catenin蛋白表达。qRT-PCR检测Wnt信号下游基因MMP-13、c-myc mRNA的表达。

1.5.1qRT-PCR检测 内参为GAPDH，引物合成是武汉擎科公司，在NCBI网站完成引物设计与验证。见表1。Trizol法提取样本总RNA：取冻存软骨组织(-80℃)，剪碎，研磨，加入Trizol试剂，匀浆完成后静置加入氯仿，离心，可见RNA-蛋白-DNA三相。将上层RNA转移EP管中加入异丙醇，离心得到白色RNA沉淀；根据说明书操作，最后取焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解后的RNA测定、计算样本RNA浓度，进行qRT-PCR；采用2-△△Ct分析最终目的基因的表达量。

表1 qRT-PCR引物序列表

1.5.2Western印迹检测蛋白表达 根据说明书要求，完成蛋白样品的制备及提取，即：称量后将软骨组织块剪碎，液氮研磨和钢珠(钢珠直径：0.9～2.0 mm混合)研磨。加裂解液裂匀浆，裂解，离心，稀释牛血清白蛋白(BSA)标准品。将蛋白样品、标准蛋白按组依次加入96孔板内，将BCA试剂盒混合后加入96孔板内(200 μl/孔)。37℃温箱孵育后酶标仪测OD值(OD568)。算出样品蛋白浓度。最后凝胶分析软件分析灰度值。

1.5.3关节病理观察 软骨取材后，病理标本经中性甲醛溶液固定、脱钙、透蜡包埋等处理，苏木素-伊红(HE)染色(由专人检测、观察病理标本)，病理改变参考改良版Mankin〔9〕评分对患膝关节软骨标本造模情况进行分析并评分。

1.6统计学方法 采用SPSS23.0软件进行LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组关节软骨病理改变比较 干预4 w后，空白组关节面软骨无退行性改变，软骨细胞无变性、萎缩，分布均匀；模型组关节面软骨重度退行性改变，软骨细胞重度变性、萎缩，分布紊乱；巴布膏对照组关节面软骨轻度退行性改变，软骨细胞轻度变性、萎缩，分布轻度紊乱；五藤膏低、中、高量组，量越低越接近模型组的退变程度；量越高，越接近空白组的细胞分布和数量，软骨退变程度越低。见图1。

图1 各组关节软骨病理改变(HE，×200)

2.2各组兔膝关节软骨组织病理改良版Mankin评分比较 空白组兔膝关节软骨组织病理Mankin评分〔(0.90±0.74)分〕显著低于模型组〔(2.30±1.25)分，P<0.05〕，五藤膏低、中、高量组〔(7.80±0.63)、(4.80±0.63)、(3.40±0.70)分〕及巴布膏对照组〔(4.70±0.82)分〕兔膝关节软骨组织病理Mankin评分均低于模型组，除低量组外均有统计学差异(P<0.05)；五藤这各量组内比较，评分从低到高分别为高量组、中量组、低量组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.3各组β-catenin蛋白表达水平比较 模型组兔膝关节软骨组织β-catenin表达水平(0.08±0.03)最低，空白组表达水平(0.52±0.06)最高，模型组、五藤膏低量组(0.20±0.06)、中量组(0.31±0.02)β-catenin蛋白表达水平均明显低于空白组(t=11.380,P=0.000；t=6.321,P=0.003;t=5.827,P=0.004)；五藤膏低、中、高(0.38±0.08)量组、巴布膏对照组(0.44±0.03)β-catenin蛋白表达水平均明显高于模型组(t=2.886,P=0.045;t=11.880,P=0.000;t=5.913,P=0.004;t=15.840,P=0.000);五藤膏低、中量组β-catenin蛋白表达水平均明显低于巴布膏对照组(t=5.812,P=0.004;t=7.512,P=0.002)；五藤膏低量组β-catenin蛋白表达水平均明显低于五藤中、高量组(t=2.935,P=0.043;t=3.043,P=0.038)。见图2。

1～6：空白组；模型组；五藤膏低量组；五藤膏中量组；五藤膏高量组；巴布膏对照组图2 各组干预4 w后软骨组织中β-catenin蛋白表达

2.4各组不同时间点MMP-13 mRNA表达水平比较 与空白组相比，模型组、五藤膏低、中量组1～4 w MMP-13 mRNA的表达水平均均明显高于空白组(P<0.05)，五藤膏高量组、巴布膏对照组1～4 wMMP-13 mRNA的表达水平略高于空白组，但无显著差异(P>0.05)；与模型组相比，五藤膏低、中、高量组及巴布膏对照组1～4 w MMP-13 mRNA的表达水平均明显低于模型组(P<0.05)。治疗组组内比较，五藤膏低量组1～4 w MMP-13 mRNA的表达水平均明显高于五藤膏中、高量组及巴布膏对照组(P<0.05)，但五藤膏中、高量组及巴布膏对照组比较无显著差异(P>0.05))。见表1。

2.5各组不同时间点c-myc mRNA表达水平比较 模型组、五藤膏各量组1～4 w c-myc mRNA表达水平均明显高于空白组(均P<0.05)；五藤膏各量组及巴布膏对照组1～4 w c-myc mRNA表达水平均明显低于模型组(均P<0.05)；模型组、五藤膏低、中量组1～4 w c-myc mRNA表达水平均明显高于巴布膏对照组(均P<0.05)；五藤膏低量组1～4 w c-myc mRNA表达水平均明显高于五藤膏高量组(均P<0.05)；五藤膏低量组第4周c-myc mRNA表达水平明显高于五藤膏中量组(P<0.05)；五藤膏中量组1 w c-myc mRNA表达水平明显高于五藤膏高量组(P<0.05)，见表2。

3 讨 论

KOA的发病机制尚不完全清楚，病理学变化可见骨赘、半月板、关节囊及软骨组织病变。生物学改变为炎症细胞因子、代谢因子、基质成分等表达异常，使膝关节软骨细胞增殖、凋亡失衡，导致KOA的发生。β-catenin作为Wnt信号的枢纽蛋白，主要在细胞膜、细胞核中存在〔10〕，且具有细胞黏附及信号传递活性。有研究显示，过度上调β-catenin表达，导致Wnt/β-catenin信号通路被激活，影响其通路下游的相关基因表达，如MMP-13，而MMP-13作为MMPs中最有效的Ⅱ型胶原降解酶，可加速软骨细胞降解、凋亡〔11〕，但阻止β-catenin的表达或其表达过低也可加速软骨细胞降解、凋亡，导致骨关节炎的发生〔12〕。中医药在调节Wnt/β-catenin通路时通常以上调或下调Wnt蛋白及关键因子(β-catenin)，促进其软骨细胞增殖或抑制相关基因的表达，从而起到治疗KOA 的作用〔13〕。β-catenin是一种具有高度保守和稳定的多重信号转导分子，且作为胞质蛋白及转录蛋白存在于各种类型的细胞膜、胞质和胞核中，是核膜共表达蛋白〔14〕，在软骨细胞的分化、增殖和凋亡中发挥重要作用〔15〕。β-catenin与细胞膜上的钙黏蛋白作用发挥其黏附功能，当上调β-catenin蛋白的表达时，其胞间黏附作用也随之增强，可抑制软骨细胞转运、分化及骨下成骨转化，但当下调β-catenin蛋白的表达时，黏附功能减弱，则可加速细胞间相关因子的转运；β-catenin作为具有转运功能的Wnt信号下游元件，又参与到软骨细胞增殖过程中。所以作为Wnt/β-catenin信号通路的关键因子，β-catenin表达水平对KOA中关节软骨细胞发挥正常功能尤为重要，是干预、治疗KOA的关键靶点。

软骨主要由细胞外基质组成，其中Ⅱ型胶原降解酶占60%，MMP-13可优先将其降解，破坏关节软骨。最新研究发现，Wnt/β-catenin信号转导通路调控下游MMPs和骨形态发生蛋白(BMP)家族基因的表达水平〔16〕。近年来研究发现骨关节炎中存在许多蛋白酶，其中MMPs作为软骨基质降解的关键蛋白酶，以MMP-3、13与KOA发病过程关系最为紧密〔17〕。MMPs的主要病理作用有组织破坏(如类风湿关节炎、骨关节炎等)，基质降解(如再狭窄性病变)等；MMP-13通常不存在正常组织细胞中，而常分布于病理性组织重构及关节炎等环境中。研究表明，在骨关节炎患者关节软骨中MMP-13表达较高，且过度上调β-catenin的表达，可增加MMP-13基因的表达量，使c-myc的表达产生异常，使通路下游软骨基质降解，增加软骨细胞的分化、增殖速度，破坏关节软骨〔18～21〕。

本研究结果证明β-catenin不仅与KOA发生发展有很大的关联性，同时也与KOA软骨组织的病变进程有很大的相关性，苗药五藤膏可通过软骨组织抑制其表达，说明其通路的下游基因MMP-13、c-myc与KOA的发生发展也有着密切联系，且其表达水平与疾病进程有很大的相关性，证实MMP-13、c-myc mRNA的表达与KOA关节软骨退变程度及疾病进展呈正相关。