(石家庄市食品药品检验中心，石家庄 050011)

杞菊地黄丸由枸杞子、菊花、熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻等8味中药组成。方中泽泻为佐使药，泻肾降浊，与君药臣药相结合，发挥滋肾养肝明目的功效，在方剂中发挥了重要药理作用。泽泻中的23-乙酰泽泻醇B为三萜类化合物，是发挥泽泻药理作用的主要成分[1]。目前关于杞菊地黄丸的质量标准研究更多地是关于莫诺苷、马钱苷和丹皮酚的含量测定[2-5]，对其他药味的含量研究较少。本文参考相关文献研究建立了超高效液相色谱法(UPLC)测定杞菊地黄丸中泽泻指标成分23-乙酰泽泻醇B 的含量。并依据JJF1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[6]、JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》[7]及参考其它的相关文献[8-12]分析各不确定度来源，对测量过程的不确定度进行分析。为质量控制和检验结果的准确性评估提供依据。

1 仪器与试药

Waters UPLC H-Class型超高效液相色谱仪(PDA检测器)；梅特勒-托利多电子天平；Elmasonic P 超声波清洗仪；Milli-Q超纯水仪。

23-乙酰泽泻醇B(批号111846-201203，纯度99.5%)；杞菊地黄丸(大蜜丸)(批号17010781)；甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯；水(超纯水)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)；流动相：乙腈-水(54∶46)；流速：0.5 mL·min-1；检测波长：208 nm；柱温35 ℃；进样体积：2 μL。

2.2 对照品溶液的制备

取23-乙酰泽泻醇B对照品10 .09mg，精密称定后置于200 mL量瓶中，加入适量80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液。精密量取上述储备液10 mL，置100 mL量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取杞菊地黄丸，剪碎，取约2.0 g，精密称定后置于具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，密塞，称定重量，超声处理1 h，放冷后再称定重量，用80%甲醇补足减失重量，摇匀，用0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学验证试验

2.4.1专属性考察

按照杞菊地黄丸处方和生产工艺制备缺泽泻的阴性样品，照“2.3”项下所述方法制备阴性对照样品溶液，按照“2.1”项下所述色谱条件进行测定，记录色谱图。结果表明，样品中23-乙酰泽泻醇B 分离良好，阴性样品在23-乙酰泽泻醇B峰相对应的保留时间无色谱峰(图1)。

图1 专属性液相色谱图1.23-乙酰泽泻醇B；A .23-乙酰泽泻醇B对照； B.供试品 C.缺泽泻阴性供试品

2.4.2线性关系考察

将“2.2”项下所述储备液用80%甲醇分别制成每1mL含23-乙酰泽泻醇B 1.07 μg、2.13 μg、5.33 μg、10.66 μg、21.32 μg、50.30 μg的对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。以浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。23-乙酰泽泻醇B的线性回归方程为Y=3818.3X-1648(r= 0.9997)，结果表明23-乙酰泽泻醇B在1.07～50.30 μg·mL-1范围内，线性关系良好。

2.4.3精密度考察

吸取“2.2”项下所述23-乙酰泽泻醇B对照品溶液，照“2.1”项下色谱条件进行测定，连续进样6次，记录峰面积，23-乙酰泽泻醇B的峰面积的RSD为0.73%。

2.4.4稳定性考察

取2.4.5项下供试品1份，照2.1项下所述色谱条件，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24h进样，记录色谱图，23-乙酰泽泻醇B的峰面积的RSD值为1.48%。

2.4.5重复性考察

取杞菊地黄丸供试品(批号：17010781)，按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，测得6份样品23-乙酰泽泻醇B的含量RSD值为1.39%。

2.4.6准确度考察

取杞菊地黄丸供试品(批号17010781)约1.0g，精密称定，共9份，按“2.3”项下方法制备低、中、高浓度加样回收样品各3份，并测定，计算回收率。结果23-乙酰泽泻醇B的平均回收率为99.8%，RSD为1.9%。

2.5 结果

本试验通过对比不同的提取溶剂、提取时间及提取方法[13-17]，考察不同流动相种类与配比[18]，最终确定了上述含量测定方法。该方法专属性强、准确度高，重现性好，可作为杞菊地黄丸中泽泻的质量控制方法。

3 不确定度分析

3.1 数学模型的建立及不确定度来源分析

按外标法建立23-乙酰泽泻醇B含量测定公式：

式中

Y：供试品中23-乙酰泽泻醇B含量，μg·g-1；

Ax：供试品峰面积；

AR：对照品峰面积；

mx：供试品的称样量，g；

mR：对照品的称样量，mg；

PR：对照品的纯度；

Vx：供试品的稀释体积，mL；

VR：对照品的稀释体积，mL。

由公式可得，Ax、AR、mx、mR、PR、Vx、VR为含量测定的不确定度来源，且各分量互不相关。

3.2 测量不确定度各分量的评定

3.2.1对照品的纯度引入的相对不确定度urelYPRY

3.2.2对照品的称样量引入的相对不确定度urelYmRY

3.2.2.1天平最小分辨率的标准不确定度

对照品称量采用梅特勒公司XS105型天平(d=0.01)，最大允许误差0.1mg，依据B类评定规则，按矩形分布计算：

3.2.2.2最大允许误差的标准不确定度

天平计量检定证书所示，该天平最大允许误差为0.04 mg，依据B类评定规则，按矩形分布计算：

实际对该品种进行检验时，对照品称样量为10.09mg，则对照品称量的相对标准不确定度：

3.2.3供试品称样量引入的相对不确定度urelYmxY

此分量的不确定度分析同对照品“3.2.2”，供试品称样采用直接称定，则

=6.22×102mg

供试品称取2份平行样，分别为2004.8 mg与2003.2mg，则

3.2.4对照品配制过程由体积引入的不确定度μrel(VR)

其不确定主要是由配制过程中量器校准和温度引入。

中共中央党校(国家行政学院)教授车文辉以《生态文明视域下的乡村振兴》为题，重点阐述了乡村振兴战略实施过程中的生态文明建设问题，指出了乡村建设、经济开发进程中忽视生态、破坏生态的现象以及带来的严重后果，提出生态建设、生态保护是乡村振兴题中应有之义，生态文明好不好决定着乡村振兴的质量。

3.2.4.1量器校准引入的不确定度

本次对照溶液的配制过程用到200mL 、100mL单标量瓶及10mL单标吸管，且均为A级。通过查看JJG 196-2006《常用玻璃量器检定规程》可知200 mL、100mL单标量瓶及10mL单标吸管(A级)容量允许误差分别为±0.15 mL、±0.10 mL、±0.020 mL。量器校准按三角分布计算，以上3种配制量器的校准引起的相对不确定度为：

=3.70×104

3.2.4.2温度引入的不确定度

玻璃量器的校准温度为20℃，实验室温度一般为25℃，25℃下80%甲醇的膨胀系数为9.86×10-4，属于B类不确定度，按矩形分布计算，对照品配制过程中由温度引入的不确定度为：

则对照品稀释过程中引入的不确定度为：

3.2.5供试品溶液配制过程中由体积引入的不确定度μrel(Vx)

此不确定度分析同对照品稀释过程“3.2.4”，供试品溶液配制过程中用到20mL单标吸管(A级)，其容量误差为±0.030mL,则

样品稀释过程中引入的不确定度为：

=2.85×103

3.2.6对照品峰面积引入的不确定度μrel(AR)

峰面积重复性误差属于随机误差，属于测量不确定度的A类评定。本次试验精密称取23-乙酰泽泻醇B对照品1份，平行进样2次，测定色谱峰面积，结果23-乙酰泽泻醇B的峰面积分别为18666、18584，两者差值R=92，平均峰面积18625，采用极差法计算，当n=2时，极差系数C=1.13，则对照品峰面积引入的相对不确定度为：

3.2.7供试品溶液峰面积引入的相对不确定度urelYAxY

此分量的不确定度分析同“3.2.6”， 供试品为两个平行样品，分别连续进样2次测定其峰面积，测定结果见表1。

表1 供试品峰面积测定结果

则供试品峰面积引入的不确定度：

=5.70×103

3.3 合成相对标准不确定度及扩展不确定度的计算

测量结果符合正态分布，包含概率为95%时，包含因子k=2，相对扩展不确定度urel=kU=2×1.27×102=2.54×102

表2 各分量的相对标准不确定度

本实验中，UPLC法测定杞菊地黄丸中23-乙酰泽泻醇B含量测量结果表示为57.2±0.0254μg·g-1，k=2。

4 结论

研究了UPLC法测定杞菊地黄丸中23-乙酰泽泻醇B的含量，方法专属性强高，灵敏度高，重复性好，为杞菊地黄丸质量控制提供了参考。同时本文还对该方法不确定度各分量的数值进行评估，表明对照品称量引入的不确定度最大，应考虑选择精度更高的天平，或增大对照品的称样量和称量份数；本试验可为类似的研究提供参考。