赵莉娟，李崇翔，乔 桥，王钰珺，曹 轩，杨丽丽，张建恒*，何培民*

1上海海洋大学 海洋生态与环境学院；2水域环境生态上海高效工程研究中心，上海 201306

浒苔类绿藻广泛分布于世界各地，有的生长在海水或淡水河流中，有的生长在潮间带的岩石或泥沙滩的竹筏等附着基上[1]。目前全世界已知的浒苔种类有80余种，中国约有11种[2]。有些绿藻快速生长聚集在一起而引起绿潮。绿潮暴发会带来一系列的次生环境问题，如藻体大量漂浮在海水表面，引起遮荫效应，导致底层植被无法进行光合作用而退化死亡；藻体堆积在岸上腐败散发恶臭，甚至滋生病菌；藻体沉降到海底后会引起缺氧和底质腐败，改变底层水体和沉积的物理化学性质，进而对海洋生态环境和生态服务功能造成严重影响[3]。

自2007年以来，我国黄海已连续14年暴发大规模绿潮灾害，造成了巨大经济损失，甚至威胁到我国近海生态安全。目前，国内外科研工作者已对黄海绿潮源头探索[4]、暴发机制[5]、漂移路径[6]、预测预警[7]等进行了深入研究，取得了一系列重要成果。引起黄海绿潮暴发的优势种浒苔(Ulvaprolifera)其实是一种经济海藻，据《本草纲目》和《随恩居饮食谱》记载，它具有凉血、泄热、利尿、消痰、软坚散和降低胆固醇等功效[8]。现代研究内容主要体现在浒苔多糖上，浒苔多糖已被证明具有降血脂、抗氧化、提高免疫力和抑制皮肤癌等药理活性[1]。此外，浒苔还有除菌洗涤、做纤维纺丝、吸声材料以及修复富营养化海域生态[9]等作用。近年来，浒苔越来越多的被用于食品行业中，在日本和韩国，浒苔是一种奢侈的调味料，只在高档料理中使用，价格高昂。在我国，浒苔被磨成藻粉，可添加到其他食品中，目前已产业化生产浒苔虾仁、浒苔面条、浒苔麻花等产品。浒苔在应用的过程中主要归功于其具有独特的香味。因此，摸清绿潮浒苔藻体中的挥发性风味物质及成分对绿潮资源合理利用和发展至关重要。

目前国内关于绿潮藻的研究常见于其种类鉴定[10]、生活史[11,12]、组织培养[13,14]、实验生态[15]等方面，对绿潮藻营养成分分析的研究已经有了一定进展，但多集中在对具体某一个地点或某一海域的绿潮藻进行成分分析，关于绿潮藻在整个漂移过程中成分变化情况的研究，尤其是绿潮藻在整个漂移过程中的挥发性风味物质的变化情况的研究鲜有报道。本研究通过对绿潮漂移全程各个阶段进行样品采集，并开展挥发性风味物质分析，结合香气阈值，筛选和确定不同区域绿潮优势种浒苔的主要香气成分，为绿潮浒苔食品开发和资源化利用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

根据历年绿潮发生发展规律，2020年3月～7月采用船舶实时跟踪监测绿潮漂移路径，并采集不同区域的漂浮绿潮藻(采样站位见图1，具体站位名称见图注)，将采集的样品低温条件下运回实验室，用灭菌海水及毛笔刷去附着在藻体上的杂藻等。然后挑选出单株的健康绿潮藻，去除多余水分，用天根植物基因组DNA提取试剂盒DP305进行总DNA的提取并测序鉴定。剩余样品进行干燥粉碎后备用。

图1 采样点位置图Fig.1 Location diagram of sampling stations注：RD：如东；DF：大丰；SY：射阳；LYG：连云港；RZ：日照；QD：青岛；HY：海阳；RS：乳山，下同。Note: RD: Rudong;DF: Dafeng;SY: Sheyang;LYG: Liangyungang;RZ: Rizhao;QD: Qingdao; HY: Haiyang;RS: Rushang,the same below.

1.2 试剂与仪器

DNA提取试剂盒(DP305，天根)；水浴锅(KW-1000DC，金坛市科析仪器有限公司)；丁位辛内酯标准品(色谱纯，上海源叶生物科技有限公司)；固相微萃取装置(57330-U，supelco)；固相微萃取针50/30 um DVB/ CAR/PDMS (57348U，supelco)；7890A-5975C型气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦公司)；气相色谱柱：HP-5MS(60 m×250 μm×0.25 μm，美国安捷伦公司)。

1.3 漂浮绿潮藻种类分子鉴定

每个站位随机选取5株完整藻体用无菌海水清洗干净，按照天根公司植物基因组小量抽提试剂盒DP305说明书提取基因组DNA，5S rDNA间隔序列引物设计以及扩增程序同2012年。利用5S rDNA间隔区序列进行PCR扩增，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，扩增产物直接送生工生物工程(上海)有限公司测序。应用Clustal X(ver 2.0)软件对样品的5S rDNA间隔序列进行多序列比对分析，然后应用Mega 4.0软件基于Kimura双参数法计算遗传距离，采用邻接法(neighbor joining，NJ)构建聚类树，以自举检验(bootstrap test)估计系统树分支节点的置信度，自举值为1 000[10]。

1.4 挥发性风味物质提取方法

称取5.0 g绿潮浒苔样品放入10 mL顶空瓶中，密封，置顶空进样器中进样。顶空条件：样品瓶加热温度60 ℃；样品瓶加热时间30 min，样品平衡时间10 min，进样时间5 min。

1.5 GC-MS条件

气相色谱条件：进样口温度250 ℃，气质接口温度250 ℃，载气流速1.5 mL/min。升温程序：初始50 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升温到100 ℃保持2 min，4 ℃/min升温到180 ℃保持3 min，5 ℃/min升温到250 ℃保持5 min。

质谱条件：离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，E电离70 eV，全扫描35～550 Da。

1.6 挥发性风味物质鉴定

采用Agilent MSD化学工作站，匹配Agilent NIST 质谱库，将检测的各组分质谱信息与 NIST 质谱库进行匹配定性，结合人工图谱解析、文献核对等多种方法进行综合分析鉴定。仅报道正反匹配度均大于80(最大值100)的结果，除去仪器自身带有的挥发性硅烷类杂质、各类塑化剂与烷烃类成分，采用内标法定量。

2 结果与分析

2.1 漂浮绿潮藻分子鉴定和分析

将8个站位随机选取的40株漂浮绿潮藻样品序列进行比对分析，并构建系统发育树，如图2所示，所有样品均被划分至同一个进化枝，其序列与Genebank中所录入的样品基因序列(HM584772.1)完全一致，确定所有漂浮绿潮藻样品均为浒苔(Ulvaprolifera)。

图2 基于5S rDNA间隔序列构建系统发育树Fig.2 A neighbor joining tree constructed from the analysis based on 5S rDNA spacer sequences

2.2 不同区域绿潮藻挥发性风味物质鉴定结果

8个区域绿潮藻样品一共鉴定到187个化合物，如下图所示，这些化合物被分成了7类，分别是醇类、醛类、烯类、酯类、酚类、烷类和其他类。

从上表1和上图3可以看出，8个区域浒苔样品的化合物类别大致相同，而各类别化合物数量和含量存在一定差异。如东绿潮藻浒苔样品中的烯类、酮类和酯类物质含量最高，射阳样品醇类和酚类物质含量最高，大丰样品烷类物质含量最高，青岛样品醛类物质含量最高。每个区域绿潮藻的化合物组成和含量有很大的差别。

图3 不同区域绿潮浒苔各类挥发性风味物质含量Fig.3 Contents of various volatile flavor substances for U.prolifera in different areas of Yellow Sea

表1 黄海不同区域绿潮藻浒苔挥发性物质含量分析Table 1 Contents of volatile components for U.prolifera in the whole Yellow Sea

2.3 不同区域绿潮浒苔挥发性风味物质气味描述和气味阈值

表2为不同区域绿潮藻浒苔挥发性化合物的气味描述和香气阈值。通过查阅相关文献，共得到58个挥发物的气味描述，其中如东至乳山8个区域的绿潮藻分别含有19、19、19、19、18、17、14、21种化合物的挥发物气味描述；在8个区域绿潮藻样品中，酯类化合物含量较高且种类丰富，其中除海阳绿潮藻外均含有二氢猕猴桃内酯，二氢猕猴桃内酯具有木香和麝香气味，其香气阈值未见报道；除青岛样品外，其他样品均含有棕榈酸甲酯，而棕榈酸甲酯具有轻微果香，其香气阈值大于2 μg/kg。结合香气成分在水中的阈值和化合物含量，初步分析如东绿潮藻的主要香气成分为丁醇、1-戊烯-3-醇、环己烯、β-紫罗兰酮、6，10，14三甲基-2-十五酮、二氢猕猴桃二酯、邻苯二甲酸酯、棕榈酸甲酯；大丰样品的主要香气成分为柠檬烯、β-紫罗兰酮、6，10，14-三甲基-2-十五酮、3,5-辛二烯-2-酮、藏红花醛、苯甲醛、二氢猕猴桃内酯；射阳绿潮藻的主要香气成分为十八醇、柠檬烯、β-紫罗兰酮、(E，E)-2，4-庚二烯醛、环高柠檬醛、苯甲醛、二氢猕猴桃内酯、乙二醇丁基醚；连云港绿潮藻的主要香气成分为十八醇、β-紫罗兰酮、己醛、壬醛、棕榈酸甲酯、乙酸乙酯；日照绿潮藻的主要香气成分可能为十八醇、柠檬烯、β-紫罗兰酮、反-2-己烯醛、己醛、壬醛、乙酸乙酯、对二甲苯；青岛绿潮藻的主要香气成分为柠檬烯、苯甲醛、反-2-己烯醛、己醛、(E，E)-2，4-庚二烯醛、壬醛、棕榈酸乙酯、乙二醇丁基醚；海阳绿潮藻的主要香气成分为十八醇、柠檬烯、β-紫罗兰酮、庚醛、己醛、壬醛、棕榈酸甲酯；乳山绿潮藻的主要香气成分为柠檬烯、十二醛，反-2-己烯醛、棕榈酸甲酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、对二甲苯。8个不同区域的绿潮藻存在相同的主要香气成分，也有各自独特的成分，导致不同地点的绿潮藻的气味存在差异。

续表1(Continued Tab.1)

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表2 部分挥发性风味物质的气味描述和阈值Table 2 Odor description and threshold of some component

续表2(Continued Tab.2)

3 讨论

本研究采用HS-SPME提取了黄海8个不同区域漂浮绿潮浒苔的挥发性风味物质，通过GC-MS分析，结果表明这8个区域漂浮浒苔的主要风味成分和含量不完全相同。醇类化合物一般气味柔和，具有植物香，对绿潮藻整体气味有着有益影响[24]。如东区域绿潮藻醇类物质种类较丰富；其中，1-戊烯-3-醇、庚醇都具有芳香气味，射阳绿潮藻中的十八醇含量较高，其呈香味，对绿潮藻气味具有较大贡献。对其他区域而言，尤其是绿潮漂移后期的山东近岸区域，其醇类物质的含量和种类都在显著下降。

在如东、大丰以及乳山绿潮藻检测出的所有挥发性成分中，烯类是含量最高的成分，主要是8-十七烯、柠檬烯、苯乙烯等；其中，如东和大丰区域绿潮藻含有较高含量的8-十七烯，而日照、青岛、海阳绿潮藻均未检测到，8-十七烯是大型海藻共有的特征风味物质[24]，在龙须菜、紫菜、红毛菜中都被检测到；而8-十七碳烯是酶促反应生成的一类化学感应物质，作为生物信息素在愈伤中起到一定的作用[25]，射阳、连云港及乳山绿潮藻中含有1-十二烯，其有强烈的刺激性气味，对绿潮藻风味有不利的影响。

酮类化合物一般具有花果香味，在绿潮藻漂移的过程中，各个区域绿潮藻的酮类物质的含量和种类都在逐步下降，除乳山绿潮藻外均检测到β-紫罗兰酮；β-紫罗兰酮具有类似松木香，稀时类似紫罗兰香，是维生素A的重要合成原料，有利于绿潮藻的芳香味产生[24]；另外，茶香酮、香叶基丙酮、二氢-β-紫罗兰酮这些物质都是具有花香、果香等令人愉快的气味，但在漂浮后期的绿潮藻中均未检测到。

醛类化合物与形成各种特异香气风格有密切关系,有文献报道醛类化合物阈值很低，对产品的风味贡献较大[24]。如东绿潮藻中藏红花醛、环高柠檬醛含量较高，它们具有木香、辛香和甜香。在生物体内，很多醛类物质都来自脂肪酸，如己醛和戊醛是亚油酸的氧化裂解产物；脂肪醛大多呈现浓烈的果香风味，还带有些许面包香气[24]。在漂浮后期的绿潮藻中均检测到反-2-庚烯醛，其具有刺激臭气味，对藻类的风味产生不利的影响。

在所有绿潮藻检测出的所有挥发性成分中，酯类化合物含量较高且种类丰富，一般酯类化合物具有令人愉悦的香气，而且酯类化合物的气味阈值一般较低，推测酯类化合物对绿潮藻的整体气味有很大贡献。研究结果表明，随着绿潮藻的北向漂移，其酯类物质的总体含量在逐步下降，例如二氢猕猴桃内酯、棕榈酸甲酯，它们都具有果香、木香的气味，而且二氢猕猴桃内酯在食品工业和卷烟工业中也有着重要的应用价值[26]，但其含量随着漂移整体在逐渐减少，对整体的风味贡献也在减少。

值得注意的是在乳山样品中检测出一定含量的萘，这类化合物一般是由环境污染物不断富集而形成的，这可能是导致乳山绿潮藻风味不佳的原因[27]，另外，只在乳山样品中检测到噻唑和吡嗪类物质，据有关文献报道[28]，其与浒苔的苦味有关系，这也间接证明了漂移后期绿潮藻风味不佳。

挥发性风味物质的种类及含量决定着绿潮藻的品质。结合8个不同区域绿潮藻中化合物的含量和阈值，可知不同区域绿潮藻不仅具有特有的香气特征成分，还具有相同的关键香气成分，例如苯甲醛、环高柠檬醛、柠檬烯、β-紫罗兰酮等。参考Li[29]的研究成果，海藻类挥发性成分的变化跟养殖海域有着密切的关系，且由于藻体本身对环境物质有着较大的吸附能力，挥发性组分的变化就可能会跟养殖海区本底物质的变化有关。结合对不同区域绿潮藻的分子鉴定结果，当绿潮藻品种相同时，环境因子对绿潮藻的挥发性风味物质影响较大，在今后可深入研究环境因子如温度，光照，海水水质、营养盐成分等方面对挥发性代谢物的影响。

4 结论

绿潮藻作为一种海洋资源，且有多种保健功效，具有很好的生产利用价值和市场开发前景。本研究通过采用顶空固相微萃取方法萃取绿潮藻的挥发性风味成分并结合GC-MS联用仪分析鉴定，可准确检测出黄海海域漂浮绿潮藻挥发性风味物质的组分，初步确定了各个区域绿潮藻的主要香气成分。结果表明不同区域的绿潮藻风味不尽相同，在绿潮藻漂移过程中，从江苏如东到山东乳山，其挥发性物质种类和含量都在逐渐下降，也表明了其整体品质在下降。相比较而言，南黄海绿潮藻品质较好，在实际应用中可用作食品产品制作；而北黄海绿潮藻由于处于漂浮区域后期，其藻体状态挥发性风味都不佳，可打捞后用作饲料、肥料以及生物质能源的开发。本研究为绿潮藻风味物质的深入研究奠定了基础，也为后续绿潮藻的开发利用提供了理论依据。