刘东旭 ， 沙万里 , 尹柏双 , 李国江

(1. 吉林农业科技学院动物科技学院 ， 吉林 吉林 132101；2. 预防兽医学吉林省重点实验室 ， 吉林 吉林 132101)

养猪业是我国畜牧业重要的支柱之一，为提高生产效率，在现代养猪生产中，普遍采用早期断奶技术，然而由于免疫发育不全以及断奶造成的各种应激，导致仔猪腹泻成为现代养猪业亟待解决的重要问题之一[1]。

抗菌肽是由12～100个氨基酸残基组成的一类蛋白质或多肽，通过与细菌细胞膜或其他靶点作用杀灭细菌[2]。本试验以乳酸菌作为表达载体，重组猪β-防御素及PR-39抗菌肽(Proline-arginine rich 39-amino acid peptide，PR-39)，观察其对断奶仔猪生长性能和微生态体系的影响，从而为研制防治仔猪腹泻的绿色无抗饲料添加剂提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 细菌选择培养基、生化鉴定瓶，均购自广东环凯微生物科技有限公司；质粒DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒，均购自爱思进生物技术(杭州)有限公司；PCR酶、TaqMan酶、DNA marker、pGEM-T SimpleVector，均购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

1.2 重组乳酸菌表达质粒的构建 根据GenBank上公布的β-防御素及PR-39抗菌肽序列设计特异性引物，由长春库美生物公司合成USP45信号肽序列。通过重叠延伸PCR法将β-防御素、PR-39抗菌肽及其融合产物与USP45信号肽进行连接。采用NcoⅠ+XbaⅠ双酶切乳酸菌表达质粒pNZ8148，根据同源臂重组技术分别将β-USP45、PR-39-USP45及融合基因β-PR-39-USP45与线性化的pNZ8148载体连接，电转入乳酸菌宿主NZ9000中并进行鉴定。

1.3 重组乳酸菌的表达及鉴定 将重组乳酸菌置于含有氯霉素及乳酸链球菌素(Nisin)的MRS培养基培养24 h，分别收集培养液和菌体进行浓缩，应用SDS-PAGE检测重组蛋白。……