贡 嘎 ， 罗润波 ， 唐 尧 ， 崔子航 ， 周赛赛 ， 索朗斯珠

(西藏农牧学院动物科学学院 ， 西藏 林芝 860000)

牛传染性角膜结膜炎是由牛摩拉氏菌(Moraxellabovis)引起的一种眼病，全世界均有流行。我国甘肃、四川、青海等地也有相关报道[1]。2018年9月份，西藏林芝某县牦牛养殖户部分牦牛眼睛先后出现红肿、流泪，严重者出现失明情况。经调查发现，该病自然发病病程达8个月，发病率95%以上，病牛体温高达38.1 ℃。笔者于2018年9月采集发病牦牛眼拭子，采用细菌学分离法进行细菌分离，通过生化及PCR方法鉴定分离菌株，确定该地区牦牛眼病发病病因，介绍如下。

1 材料与方法

1.1 病料 从西藏林芝市某县牦牛养殖户采集发病牦牛眼拭子10份，保存于-20 ℃，待检。

1.2 主要试剂 PCR试剂、DL2 000 DNA marker、克隆载体pMD18-T、细菌基因组提取试剂盒，均购自TaKaRa公司；感受态细胞Trans5α由本实验室制备保存；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；血平板，购自齐一生物科技有限公司；青霉素、头孢氨苄、头孢曲松、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢他啶、氨苄西林、新霉素、多西环素、庆大霉素、卡那霉素、红霉素共12种抗菌药物，均购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3 细菌的分离培养及纯化 无菌棉签采集患病牦牛眼拭子，接种于血平板，37 ℃ 需氧培养 18 h。将分离的单个菌落划线接种于血平板上，37 ℃培养 18 h 进行纯化。

1.4 染色镜检 将单个菌落涂片革兰染色后镜检。

1.5 生化试验 取血琼脂平板上典型的单菌落接种于靛基质、氧化酶、还原硝酸盐、石蕊牛奶等进行细菌生化试验。

1.6 分离菌株的16S rDNA基因序列测定 引物序列参照参考文献[2]，上游引物：5′-ATGGCTCATTGAACGC-3′；……