吕静祎，丁思杨，张俊虎，徐冬乐，孙明宇，张潆支，葛永红，励建荣*

（渤海大学食品科学与工程学院，辽宁 锦州 121013）

活性氧（reactive oxygen species，ROS）主要包括超氧阴离子自由基（O2-·）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（·OH）等，是对生命活动具有重要调节作用的细胞新陈代谢产物。研究表明，ROS是影响植物细胞膜脂过氧化和凋亡、导致植物衰老的主要原因之一[1-2]。果实的后熟衰老过程是ROS代谢与氧化的过程[3-4]。植物体内对ROS的清除系统主要包括两类：一类是酶促清除系统，主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（peroxidase，POD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和抗坏血酸过氧化酶（ascorbate peroxidase，APX）等抗氧化酶类；一类是非酶促清除系统，主要是一些抗氧化物质，如抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）等[5]。

苹果属于呼吸跃变型果实，是我国主产水果之一[6]。 按照苹果的成熟期早晚差异可分为早熟品种、中熟品种和晚熟品种，其中晚熟品种最耐贮藏，中、早熟品种则不耐贮藏。对枣、梨、葡萄及杏等果实上的研究表明，ROS代谢与不同品种果实的耐贮藏性密切相关[7-10]。辽宁省是我国重点苹果产区之一，主栽品种包括‘金冠’‘富士’‘寒富’‘国光’等。其中，‘金冠’是中熟品种，采后易失水皱缩、软化，易患传染性果腐病等，货架期不超过1 个月，不耐贮藏[11-12]；而‘富士’晚熟品种采后呼吸代谢低，耐贮藏，常温下可贮藏3～4 个月[13]。‘金冠’和‘富士’也是世界上的两大主栽品种。本研究以‘金冠’和‘富士’两个苹果品种为试材，分析常温后熟期间ROS代谢相关变化，旨在为进一步深入研究不同品种苹果耐贮藏性差异的分子机理提供理论依据，也为找到新的苹果贮藏保鲜方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘金冠’与‘富士’苹果分别于2017年9月16日和2017年10月7日采于辽宁锦州一果园。随机选取大小、成熟度一致，无病虫害和机械损伤的‘金冠’苹果150 个、‘富士’苹果390 个，分别用5 层瓦楞超硬纸板箱包装，每箱30 个果，当天运回实验室。

乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、盐酸羟胺、对氨基苯磺酸、α-萘胺、冰醋酸、浓氨水、硫酸、四氯化钛、 硫代巴比妥酸、盐酸、丙酮、氮蓝四唑、三氯乙酸、无水醋酸钠、愈创木酚等试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

722N可见分光光度计、GXH-3051H型果蔬呼吸测定仪 上海精密科学仪器有限公司；UV-2550紫外-可见分光光度计、GC-14A型气相色谱仪 日本岛津公司； GY-3指针式水果硬度计 浙江托普仪器有限公司；TGL-16高速冷冻离心机 湖南湘立科学仪器有限 公司。

1.3 方法

1.3.1 苹果贮藏

苹果于（23±2）℃、相对湿度为（65±5）%的条件下贮藏。每7 d分别随机取15 个果实，进行硬度、呼吸强度和乙烯释放量的测定；并分别选取6 个果实，将果肉切成边长约0.2 cm的正方体后用液氮速冻混匀，置于-80 ℃保存备用。

1.3.2 硬度、呼吸强度及乙烯释放量的测定

参考Lü Jingyi等[14]的方法，选取15 个苹果测定呼吸强度和乙烯释放量。将15 个果实分为3 份，每份5 个，称质量后置于12 L干燥器中常温密封1 h，然后收集1.0 mL气体，用气相色谱仪测定呼吸强度和乙烯释放量，测定结果取平均值。呼吸强度和乙烯释放量的结果分别以每秒每千克果实释放的CO2物质的量和释放的乙烯物质的量表示，单位均为nmol/（kg·s）。随后对果实进行硬度的测定，在每个果实的赤道部位，间隔等距离选择3 个点，削去一小块厚约1 mm 的果皮，用GY-3指针式水果硬度计测定此3 个位置处果肉的硬度。

1.3.4 SOD、POD、CAT、APX和谷胱甘肽还原酶 活力的测定

SOD与POD活力的测定参考王阳等的方法[17]。CAT活力的测定参考Wang Yousheng等的方法[18]。APX活力的测定参考文献[19]。谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）活力的测定参考Labo等的方法[20]。

1.4 数据处理与分析

上述各指标均重复取样3 次，每个样品重复测定3 次，取平均值。数据均以平均值±标准差表示。采用Excel 2010进行数据分析与作图，用SPSS 22对数据进行t检验并进行统计分析。P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 苹果贮藏过程中硬度、乙烯释放量和呼吸强度的变化

如图1A所示，两个品种的果肉硬度在整个贮藏期间呈现下降趋势，‘金冠’在贮藏35 d时的果肉硬度为4.80 kg/cm2，而同一时间‘富士’的果肉硬度则为7.97 kg/cm2，是‘金冠’的1.66 倍。如图1B～C所示，‘金冠’果实的呼吸强度和乙烯释放量均在贮藏28 d时达到高峰，而‘富士’则在贮藏77 d时达到高峰。‘金冠’果实的呼吸强度和乙烯释放量在贮藏期间均显著 或极显著高于‘富士’（P＜0.05、P＜0.01），且峰值分别为‘富士’的2.70 倍和2.22 倍。可见，‘金冠’由于高的呼吸强度和乙烯释放量，成熟衰老较快，因此贮藏期短。‘金冠’与‘富士’分别在第35天和第105天时果实硬度很低，已失去销售和食用价值，故本实验中‘金冠’与‘富士’的贮藏终点分别为第35天和第105天。

图1 不同品种苹果果实在贮藏期间硬度（A）、呼吸强度（B）和 乙烯释放量（C）的变化Fig.1 Changes in firmness (A), respiration rate (B) and ethylene production (C) of different apple cultivars during postharvest storage

2.2 苹果贮藏过程中·产生速率、H2O2含量及MDA含量的变化

图2 不同品种苹果贮藏期间·产生速率（A）、H2O2含量（B）和MDA含量（C）变化Fig.2 Changes in production rate (A), H2O2 content(B) and MDA content (C) of different apple cultivars during postharvest storage

2.3 苹果贮藏过程中ROS代谢相关酶活力的变化

如图3所示，‘金冠’中的SOD、POD、CAT活力在贮藏期间显著或极显著高于‘富士’。‘金冠’的SOD和CAT活力峰值分别出现在28、21 d，POD活力高峰出现在14 d，而‘富士’中这3 种酶的活力峰值均则出现在贮藏77 d。‘金冠’中的SOD、POD和CAT活力峰值分别为‘富士’的1.12、1.59、3.49 倍。

图3 不同品种苹果在贮藏期间SOD（A）、POD（B） 和CAT（C）的活力变化Fig.3 Changes in activities of SOD (A), POD (B) and CAT (C) in different apple cultivars during postharvest storage

2.4 苹果贮藏过程中AsA含量、APΧ及GR活力的变化

如图4A所示，两个品种苹果的AsA含量在整个贮藏期间逐渐下降，其中，‘富士’苹果中的AsA含量显著或极显著高于‘金冠’苹果（P＜0.05、P＜0.01）。在贮藏35 d后，‘富士’的AsA含量是‘金冠’的3.08 倍。如图4B所示，‘金冠’和‘富士’的APΧ活力分别在贮藏21 d和贮藏77 d达到峰值，且‘金冠’的活力峰值是‘富士’的1.95 倍。如图4C所示，在贮藏前28 d，‘金冠’的GR活力略高于‘富士’。‘金冠’和‘富士’苹果GR活力分别在28 d和77 d出现峰值，且‘富士’的峰值是‘金冠’峰值的2.11 倍（图4C）。

图4 不同品种苹果贮藏期间AsA含量（A）和APX（B）、 GR（C）活力的变化Fig.4 Changes in AsA content (A), APX activity (B) and GR activity (C) of different apple cultivars during postharvest storage

3 讨 论

呼吸作用是基本的生命现象，苹果是典型的呼吸跃变型果实。呼吸跃变型果实在达到呼吸跃变高峰后，食用品质迅速下降，很快便会失去耐贮藏性[21]。呼吸跃变的发生意味着果实衰老的开始。乙烯是促进跃变型果实成熟的重要内源激素，呼吸跃变型果实呼吸高峰的出现常常伴随着乙烯合成的迅速增加[21]。本研究中，‘金冠’的呼吸高峰和乙烯高峰出现时间早于‘富士’，同时高峰值都大于‘富士’，表明‘金冠’在常温贮藏期间的呼吸代谢旺盛，后熟速度比‘富士’快，也比‘富士’提前进入衰老阶段，因此不耐贮藏。此外，果肉硬度是衡量耐贮性的重要指标[22]。由于‘金冠’成熟衰老速度比‘富士’快，在果肉硬度上则表现为硬度持续下降，软化速度快，在35 d的时候硬度为4.80 kg /cm2，果肉已经绵软，失去商品价值，而‘富士’在同一时间硬度为7.97 kg /cm2，仍保持较好的贮藏品质。

果蔬在正常生命活动中所需的O2中有1%会被传送到线粒体、叶绿体以及过氧化物酶体中用以生成ROS，高浓度的ROS会造成生物分子的损害，ROS的大量积累 对果蔬细胞有毒性，会引发膜脂过氧化，导致细胞膜系统被破坏，加速果实衰老[2,23]。通常将H2O2和O2-·等ROS水平和MDA含量作为衡量果实组织衰老程度的重要指标[15]。 本研究中‘金冠’的O2-·产生速率、H2O2和MDA的含量在常温贮藏期间（前35 d）均高于‘富士’苹果，高水平的ROS导致其膜脂过氧化加剧，进一步加速果实组织衰老，使其衰老程度在贮藏前35 d远高于‘富士’。O2-·可以通过SOD转化为H2O2，然后可以通过CAT、POD和APΧ去除H2O2[24]。本研究发现‘金冠’中SOD、POD和CAT活力在贮藏期间高于‘富士’，可能是由于高的ROS水平需要高的酶活性进行代谢[25]。谢忠斌等在乙烯处理后的菠萝蜜果实上也观察到H2O2等ROS水平增加的同时伴随着SOD、CAT等酶活力增加的现象[26]。需要注意的是，即使是‘金冠’的ROS代谢相关酶活性在常温贮藏期间高于‘富士’，但其ROS水平也高于‘富士’，成熟衰老速度比‘富士’快，推测可能是由于‘金冠’果实中ROS代谢能力不足以清除过量积累的ROS。

AsA是AsA-GSH循环中的重要抗氧化剂，它在APΧ作用下，以自身被氧化形成脱氢抗坏血酸为代价，将H2O2还原成H2O[27]。APΧ和GR是AsA-GSH循环中的两种关键酶，是抗氧化系统的关键参与者[28-29]。在AsAGSH循环中，GR可催化氧化型谷胱甘肽（glutathiol，GSSG）还原形成GSH，GSH又在脱氢抗坏血酸还原酶作用下将脱氢抗坏血酸还原成AsA，以补充AsA[30]。本研究中，‘金冠’在常温贮藏期间的APΧ活力和GR活力高于‘富士’，而AsA含量低于‘富士’，可能是与‘富士’相比，‘金冠’的AsA被APΧ氧化的量不足以通过AsA-GSH循环进行补充，因此造成其AsA含量低。H2O2可以在细胞内扩散，被认为是ROS的信号物质，其在植物体内产生途径较多，除了通过O2-·的歧化反应生成外，还可通过酶促反应生成[29]。与‘富士’相比，‘金冠’在常温贮藏期间的高H2O2含量是否与其较低的AsA水平有必然联系还需要进一步深入研究。

综上所述，‘金冠’在常温贮藏期间呼吸强度、乙烯释放速率、MDA含量、ROS水平和与ROS代谢有关的酶活力均高于‘富士’，成熟衰老速度快，贮藏期短。因此，不同品种苹果果实的耐贮藏性差异与体内ROS水平密切相关，但考虑到ROS产生和清除体系复杂性，苹果果实的耐贮藏性与ROS代谢能力的联系需要进一步研究阐明。今后应当在分子水平围绕不同品种苹果采后ROS代谢差异的作用机制进行深入研究与探讨。