吴世卿 温志欣 何翠媚 刘雄 欧阳嘉杰 廖奕翔

牙周组织再生是口腔临床治疗中面临的一个重大问题，牙周病引起的牙周软硬组织缺失、拔牙后牙槽骨高度和宽度的减少及软组织的萎缩、外科手术导致的软硬组织缺损等，均给临床治疗带来种种困难。传统的牙周组织再生方法有牙周植骨术、引导组织再生术[1]。牙周植骨术是采用骨或骨的替代品等移植材料修复牙槽骨缺损，但植骨材料骨诱导能力低，通常被大量的结缔组织覆盖；而引导组织再生术是利用生物膜作为屏障阻挡牙龈上皮及结缔组织长入，引导牙周膜细胞优先长入根面，但无骨细胞诱导能力[2]。因此寻找一种既能诱导软组织再生，亦能诱导骨组织再生的生物学材料用于调控牙周组织再生重建的过程，具有重要的科学价值与实际意义。前期实验中自主合成了新型聚己内酯纳米纤维三维支架，并与上皮角化细胞、成纤维细胞共培养，发现其具有较好的促进细胞分化和增殖的特性。因此，笔者提出新型聚己内酯纳米纤维三维支架能更好地促进人口腔源性成骨细胞和牙周成纤维细胞增殖和分化的假说。笔者拟从动物模型层面上探讨新型聚己内酯纳米纤维三维支架调控牙周组织再生的作用，为寻找一种既能诱导软组织再生，亦能诱导骨组织再生的生物学材料提供新线索，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 实验动物和试剂 选取清洁级的SD大鼠24只，8周龄，体重200～250 g，雄性，购自广东省实验医学动物中心[SYXK（粤）2016-0073]，笼内饲养，正常光照，保证相对的温度和湿度，在动物实验的过程中严格贯彻3R原则。DMEM培养液（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Sigma）；逆转录试剂盒（美国Thereto）；0.25%胰蛋白酶（江苏碧云天生物技术研究所）；BCA蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；苏木素、伊红（上海申能博彩生物技术公司）；聚己内酯（美国Sigma）；甲基泼尼松龙（上海国药集团化学试剂有限公司）。

1.1.2 实验分组和建模 将24只大鼠随机分为三组，每组8只大鼠，空白对照组（不植入任何材料）、阴性对照组（植入胶原凝胶）和实验组（植入新型聚己内酯纳米纤维三维支架），经腹部注射10%的20 mg/kg的水合氯醛麻醉大鼠，参照Botelho等[3]的研究方法建立大鼠牙周炎模型，大鼠仰卧在实验台上，使上颌磨牙充分暴露，分离牙龈到骨面，在上颌第一颗和第二颗磨牙之间置放结扎丝，确保结扎丝无松脱，结扎完成，建立大鼠牙周炎模型后，阴性对照组植入胶原凝胶，实验组植入新型聚己内酯纳米纤维三维支架，空白对照组不做任何处理，并检查结扎线是否松动脱线，持续到术后14 d。

1.2 方法

1.2.1 micro-CT定量分析 术后2周，经腹部注射10%水合氯醛麻醉大鼠，采用4%的多聚甲醛对心脏进行灌流固定，取双侧上颌骨后，从腭中缝处分为左右两个磨牙段及牙周组织联合标本，放于4%的多聚甲醛中固定。在将标本浸没在含有乙醇溶液的扫描管中，采用micro-CT扫描上颌第一颗和第二颗磨牙之间的牙槽区域，并使用计算机软件分析相关参数骨矿物质密度（BMD）、组织矿物质密度（TMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数目（Tb.N）、骨小梁分离度（Tb.Sp）和骨小梁厚度（Tb.Th）。

1.2.2 HE染色 将所取两个磨牙段及牙周组织联合标本放入4%的多聚甲醛固定，酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片后进行苏木素-伊红（HE）染色，首先放于60 ℃烤箱进行20 min烤片，脱蜡，苏木素染3 min，自来水冲洗3次，伊红染1 min，自来水冲洗2次，封片，显微镜下观察小鼠所取组织的病理学变化。

1.2.3 组织病理评分 采用0～3分等级对第一和第二磨牙之间的牙周组织的淋巴细胞、中性粒细胞和单核巨噬细胞等炎症细胞进行评价。0分为未见牙槽骨和牙骨质吸收，少量或者炎性细胞浸润；1分为牙槽骨轻度吸收，牙骨质完整，炎症细胞出现中等性浸润；2分为牙槽骨吸收破坏明显，牙骨质出现少量破坏，炎性细胞大量浸润；3分为牙槽骨吸收严重，牙骨质出现严重的破坏，上皮全层出现大量的炎症细胞。

1.2.4 Western blot检测 采用RIPA裂解缓冲液对蛋白进行提取，采用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳，转膜，然后用5%脱脂乳封闭膜，在4 ℃下，添加一抗体孵育过夜，一抗IL-6（1∶1 000）、IL-1b（1∶1 000）、MCP-1（1∶1 000）进行稀释，然后在室温下用二抗孵育2 h，最后，采用增强化学发光（ECL）试剂，β-actin作内参，检测IL-6、IL-1b、G-CSF、MCP-1蛋白表达。

1.2.5 qRT-PCR检测 采用Trizol法提取总RNA，反转录成cDNA，按照试剂说明进行实验，用DNA荧光染料SYBR GreenⅠ对Runx-2、RANK、OPG和Collagen-Ⅰ水平进行检测，Runx-2 mRNA上游5’-GGTGAGAAACCCACCACAT-3’，下游5’-GGTGCTGATGTACCAGTT-3’；RANK mRNA上游5’-GGTGAGAAACCCACCACAT-3’，下游5’-GGTGCTGATGTACCAGTT-3’；OPGmRNA上游5’-GGACTACAGATGCACCACCATTA-3’，下游5’-TGAGCACTGTGTCCATAG -3’；Collagen-Ⅰ mRNA上游5’-CCATGUAUGUAACACGGUCC-3’，下游5’-CACAAGACAATTAGG-3’；β-actin作为内参，引物序列为上游5’-AACCATCTATCCCATCATC-3’，下游5’-GCACAGTCCATAGCCTTACGAA-3’，反应条件为 92 ℃，30 min；86 ℃、69 ℃，各20 s；75 ℃，10 min；循环次数为 40次，用相对定量2-ΔΔCT计算Runx-2、RANK、OPG、Collagen-ⅠmRNA水平，并计算RANK/OPG mRNA。

1.3 统计学处理

本研究数据采用SPSS 19.0统计学软件进行分析和处理，计量资料以（±s）表示，采用t检验，多组资料间比较采用SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组牙周骨组织再生指标对比

micro-CT定量分析，阴性对照组和实验组BMD、TMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均明显高于空白对照组（P<0.05），且实验组BMD、TMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均明显高于阴性对照组（P<0.05）；阴性对照组和实验组Tb.Sp明显低于空白对照组（P<0.05），且实验组Tb.Sp明显低于阴性对照组（P<0.05），见表 1。

表1 三组牙周骨组织再生指标对比 （±s）

表1 三组牙周骨组织再生指标对比 （±s）

组别 BMD（mm3） TMD（mm3） BV/TV（%） Tb.N（mm-1） Tb.Sp（mm） Tb.Th（mm）空白对照组（n=8） 803.46±56.59 149.76±52.51 0.09±0.02 4.98±0.13 0.26±0.06 0.07±0.02阴性对照组（n=8） 827.63±49.62 306.79±71.19 0.28±0.11 7.28±1.17 0.21±0.04 0.12±0.05实验组（n=8） 851.27±62.53 357.41±76.37 0.35±0.14 9.04±1.89 0.13±0.01 0.16±0.02 F值 21.693 49.561 5.878 7.927 4.964 4.129 P值 <0.001 <0.001 0.002 0.001 0.005 0.007

2.2 HE染色观察牙周组织病理学观察

组织病理学评分结果显示，空白对照组、阴性对照组和实验组的组织病理学评分分别为（2.72±0.91）、（2.69±0.89）、（2.67±0.90）分，三组组织学评分比较差异无统计学意义（P=0.087），见图 1。

图1 HE染色结果 （×200）

2.3 三组炎症相关蛋白表达比较

Western blot实验结果显示，三组炎症相关蛋白IL-6、IL-1b和MCP-1水平比较差异无统计学意义（P>0.05），见表2、图2。

表2 三组炎症相关蛋白表达比较 （±s）

表2 三组炎症相关蛋白表达比较 （±s）

组别 IL-6 IL-1b MCP-1空白对照组（n=8） 0.36±0.02 1.03±0.04 1.27±0.05阴性对照组（n=8） 0.34±0.01 1.05±0.03 1.23±0.06实验组（n=8） 0.35±0.02 1.02±0.02 1.19±0.07 F值 2.773 1.984 2.543 P值 0.098 0.217 0.086

图2 三组炎症相关蛋白表达

2.4 三组骨及牙周膜改建相关因子表达比较

qRT-PCR检测结果显示，阴性对照组和实验组Runx-2mRNA、RANK/OPG mRNA比 值、Collagen-ⅠmRNA相 对表达均明显高于空白对照组（P<0.05），且实验组Runx-2、RANK/OPG mRNA、Collagen-Ⅰ mRNA的相对表达明显高于阴性对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

表3 三组骨及牙周膜改建相关因子表达比较 （±s）

表3 三组骨及牙周膜改建相关因子表达比较 （±s）

组别 Runx-2 mRNA RANK/OPG mRNA Collagen-Ⅰ mRNA空白对照组（n=8） 1.82±0.07 4.92±0.39 1.06±0.03阴性对照组（n=8） 2.29±0.11 7.31±0.48 2.03±0.07实验组（n=8） 3.02±0.19 16.63±1.26 2.84±0.51 F值 5.579 12.539 4.492 P值 0.003 <0.001 0.008

3 讨论

牙周病一般是指牙周膜、牙槽骨和牙骨质相关的支持组织发生慢性的破坏，该病已经成为牙齿缺失的主要原因[4]。到目前为止，牙周组织再生修复仍旧是国内外口腔医学研究的热点问题。口腔种植术是常用的修复缺失牙手段，但由于在治疗过程中会使牙槽骨产生功能性刺激丧失，进而导致软组织的萎缩和牙槽骨高度和宽度的降低，增加了种植牙植入的难度[5]。种植区软硬组织的形态和质量是影响种植体三维植入位点的远期存留的主要因素[6]。目前对于这些既有软组织缺损又有硬组织缺损的病例治疗中需同时植入软组织移植骨替代材料，缺一不可。因此如能寻找一种既能引导软组织再生、亦能引导骨组织及血管再生的生物学材料用于调控牙周组织再生重建的过程，对满足口腔医学临床的应用需求将具有重要的科学价值与实际意义。

静电纺丝技术是一种独特的纳米纤维制造技术[7]，已经在骨再生、血管再生、周围神经再生、皮肤再生等诸多组织再生领域获得了突破和进展，并被认为是最有希望在组织再生领域取得重大成果的技术[8]。笔者前期研究的新型聚己内酯纳米纤维三维支架，其是一种使用最先进的电纺技术制作、具有梯度纳米结构的生物技术制作支架材料，不仅具备静电纺丝技术的优点，还具有独特的创新之处[9]。首先，梯度纳米明胶纤维结构更有利于细胞的种植、黏附和分化；其次，聚己内酯纳米纤维三维技术增加了支架的生物相容性、耐水性和稳定性[10]。相关研究已将牙龈角化细胞、牙龈成纤维细胞接种到新型聚己内酯纳米纤维三维支架上，发现细胞层数最高可达9～10层，而对照组接种到胶原凝胶上的牙龈角化细胞和牙龈成纤维细胞最多形成3层细胞，显示出新型聚己内酯纳米纤维三维支架有较好的促进细胞分化和增殖的特性[11-13]。也有研究将新型聚己内酯纳米纤维三维支架植入中节段性骨缺损处，结果发现缺损处软组织再生[14-15]。借助以上思路，笔者建立了动物模型，进一步研究新型聚己内酯纳米纤维三维支架促牙周组织再生的作用，为临床上寻找一种能同时引导软硬组织再生的生物学材料提供理论基础依据。

本研究结果显示，实验组BMD、TMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th显著高于阴性对照组及空白对照组；实验组Tb.Sp显著低于阴性对照组及空白对照组。三组组织学评分比较差异无统计学意义（P>0.05）；三组炎症相关蛋白IL-6、IL-1b、MCP-1水平比较差异无统计学意义（P>0.05）；实验组Runx-2 mRNA、RANK/OPG mRNA、Collagen-Ⅰ mRNA的相对表达高于阴性对照组及空白对照组。提示新型聚己内酯纳米纤维三维支架抑制炎症因子的效果并不明显，而对于骨组织再生和牙周膜改建具有一定的促进作用。

综上所述，新型聚己内酯纳米纤维三维支架能促进牙龈组织、牙周膜组织、骨组织再生，弥补临床上生物膜仅能促进骨组织再生或仅能促进软组织再生功能单一性的缺陷，对满足口腔医学临床的应用需求将具有重要的科学价值与实际意义。