李会会，王迪迪，杨 彬，袁静静，陈利雪，刘秋圆，丁 浩，梅 俏，刘晓昌

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种非特异性肠道炎症性疾病，以损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)为代表的炎症介质具有增加IBD中肠黏膜通透性的作用。研究表明，IBD中DAMPs(包括HMGB1、IL-33和mtDNA等)水平增加，通过不同机制导致IBD的黏膜炎症。mtDNA作为强致炎性的DAMPs，可与Toll样受体9(Toll-like receptor 9，TLR9)结合，激活炎症通路，参与肺部炎症和关节炎等疾病的炎症过程。外源性mtDNA可以增加大鼠肺灌注通透性，阻断TLR9可以抑制这一过程，表明mtDNA在肺内皮细胞屏障破坏中起关键作用。但mtDNA是否通过调控TLR9信号通路影响肠上皮细胞的通透性尚不明确，因此该研究在建立Caco-2细胞单层模型的基础上，探讨mtDNA是否通过调控TLR9信号通路影响IBD的肠黏膜通透性及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

C57BL/6J小鼠40只(雄性，6～8周)购自安徽省实验动物中心；肝素钠、胶原酶Ⅳ购自德国BioFroxx公司；Mitochondrial DNA Isolation Kit(ab65321)试剂盒购自英国Abcam公司；Caco-2人结直肠腺癌细胞购自中国科学院干细胞库；BI血清购自以色列生物科技公司；PBS、高糖DMEM培养基购自美国Hyclone公司；青霉素-链霉素混合液、非必须氨基酸、0.25%胰蛋白酶购自北京索莱宝生物科技有限公司；MILLICEL@-ERS购自美国MILLIPORE公司；Transwell inserts(型号3413)购自美国康宁公司；FITC-dextran(分子量3-5 ku)购自美国Sigma-adrich公司；多功能酶标仪购自美国PE公司；肿瘤坏死因子-ɑ(tumour necrosis factor-ɑ,TNF-ɑ)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-1β和IL-18 ELISA试剂盒购自武汉新启迪生物科技有限公司、ODN TTAGGG(A151)购自美国Invivogen公司；TRIzol购自美国ambion公司；三氯甲烷购自上海西陇科学股份有限公司；DEPC水(RNase-free水)购自北京Biosharp公司；RT-PCR反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自日本Takara公司；Actin引物、TLR9引物由上海生工生物工程股份有限公司设计与合成；qRT-PCR仪购自美国Agilent Mx3000P公司。

1.2 方法

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mtDNA提取 采用胶原酶Ⅳ消化法制备小鼠肝细胞，按Mitochondrial DNA Isolation Kit(ab65321)试剂盒方法提取mtDNA。用超微量分光光度计检测mtDNA的浓度以及纯度，A260/A280的值在1.8～2.0之间表明mtDNA纯度高，无蛋白质污染。-20°保存备用。

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建立Caco-2细胞单层模型 Caco-2细胞培养于37 ℃、5% CO的细胞培养箱中，使用10% BI血清、1%非必须氨基酸和1%青霉素-链霉素溶液进行培养，根据细胞生长状况2～3 d更换1次培养基，显微镜下观察细胞汇合程度达到80%时，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，重悬细胞并计数，以5×10个/孔的密度接种于24孔Transwell inserts中，第一周每2 d更换1次培养基，之后每天更换1次培养基，直至21 d。根据说明书，采用 MILLICEL@-ERS (MILLIPORE)测量TEER，待TEER为400-550(Ω×cm)时表明Caco-2细胞单层模型建立成功。

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Caco-2细胞通透性检测 通过测量TEER和FITC-dextran跨膜转运量来评估Caco-2细胞通透性。

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实验分组 在Transwell inserts顶侧加入不同浓度的mtDNA(0、1、5、10 μg/ml)和FITC-dextran处理Caco-2细胞单层，分别在0、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h测量并记录各孔TEER，同时于底室取样保存于-80 ℃冰箱备用。样品在激发波长为480 nm，发射波长为520 nm条件下，用多功能酶标仪检测各孔中FITC-dextran的荧光值，根据标准曲线计算出各孔FITC-dextran浓度。根据TEER和FITC-dextran含量确定最佳mtDNA浓度，然后在Transwell inserts顶侧分别加入FITC-dextran、mtDNA+FITC-dextran、ODN TTAGGG+FITC-dextran和mtDNA+ODN TTAGGG+FITC-dextran，检测不同时间TEER和底室中FITC-dextran含量的改变。

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炎症因子检测 Caco-2细胞培养于37 ℃，5% CO的细胞培养箱中，以3×10个/孔密度接种于6孔板，用10 μg/ml 的mtDNA作为对照， ODN TTAGGG作为 TLR9信号通路拮抗剂，孵育1 h后，用ELISA试剂盒检测上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18的水平

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qRT-PCR检测TLR9 mRNA表达 将Caco-2细胞接种于6孔板，待细胞汇合度达到80%时，用10 μg/ml 的mtDNA作为对照， ODN TTAGGG作为 TLR9信号通路拮抗剂，0.5 h后，用TRIzol 提取RNA，用Takara公司的逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，采用QuantiNova SYBR Green PCR试剂盒进行定量PCR反应，反应条件为95 ℃、2 min一个循环；95 ℃、5 s，60 ℃、15 s，72 ℃、20 s共40个循环。内参为β-actin，用2方法计算TLR9 mRNA的相对表达量。β-actin引物序列：正向引物5′-GGCACCACACCTTCTACAATGAGC-3′，反向引物5′-GATAGCACAGCCTGGATAGCAACG-3′；TLR9引物序列：正向引物5′-GCATCTCGCAGGCAGTCAATGG-3′，反向引物5′-CCGTGAATGAGTGCTCGTGGTAG-3′。

2 结果

2.1 mtDNA对Caco-2细胞单层通透性的影响

用不同浓度的mtDNA(0、1、5、10 μg/ml)处理Caco-2细胞单层，结果表明，随着浓度的增加，mtDNA可以降低Caco-2细胞单层的TEER(图1)，Transwell底室中的FITC-dextran含量增加(图2)，在2 h内达到最大改变值。其中，以10 μg/ml的mtDNA对Caco-2细胞单层通透性改变最为显著，提示mtDNA对细胞单层通透性的影响具有一定的量效和时效过程。

图1 不同浓度mtDNA对Caco-2细胞单层TEER的影响

2.2 ODN TTAGGG对mtDNA引起的Caco-2细胞单层通透性增加的影响

用TLR9拮抗剂ODN TTAGGG与10 μg/ml mtDNA 一起处理Caco-2细胞单层，如图3、4所示，与mtDNA组相比，ODN TTAGGG预处理抑制mtDNA引起的通透性增加，表明TLR9参与mtDNA引起Caco-2细胞单层通透性增加的作用过程。

图2 不同浓度mtDNA对Caco-2细胞单层FITC-dextran渗透的影响

图3 ODN TTAGGG对mtDNA预处理Caco-2细胞单层TEER的影响

2.3 mtDNA对Caco-2细胞的炎症因子水平的影响

用10 μg/ml 的mtDNA作为对照，ODN TTAGGG作为TLR9信号通路拮抗剂处理Caco-2细胞，1 h后取Caco-2细胞培养上清液检测TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18的水平。如图5～8所示，与对照组相比，差异有统计学意义(

F

=130.792，

P

<0.01；

F

=461.679，

P

<0.01；

F

=85.030，

P

<0.01；

F

=205.689，

P

<0.01)。ODN TTAGGG预处理可降低mtDNA引起的TNF-ɑ、IL-6、IL-1β和IL-18炎症因子水平的增加，差异有统计学意义(

F

=137.030，

P

<0.01；

F

=380.618，

P

<0.01；

F

=131.536，

P

<0.01；

F

=1 247.583，

P

<0.01)。

图4 ODN TTAGGG对mtDNA预处理Caco-2细胞单层FITC-dextran渗透的影响

图5 mtDNA及ODN TTAGGG对Caco-2细胞TNF-ɑ的影响

图6 mtDNA及ODN TTAGGG对Caco-2细胞IL-6的影响

2.4 mtDNA对Caco-2细胞TLR9 mRNA表达水平的影响

用10 μg/ml 的mtDNA作为对照，ODN TTAGGG作为TLR9信号通路拮抗剂处理Caco-2细胞，0.5 h后检测Caco-2细胞的TLR9 mRNA水平。如图9所示，与对照组相比，10 μg/ml 的mtDNA可以引起TLR9 mRNA表达水平增加， 差异有统计学意义(

F

=135.611，

P

<0.01)；ODN TTAGGG预处理可降低mtDNA引起的TLR9 mRNA表达水平增加，差异有统计学意义(

F

=224.742，

P

<0.01)。

图7 mtDNA及ODN TTAGGG对Caco-2细胞IL-1β的影响

图8 mtDNA及ODN TTAGGG对Caco-2细胞IL-18的影响

图9 mtDNA及ODN TTAGGG对Caco-2细胞TLR9 mRNA表达水平的影响

3 讨论

IBD是一种原因不明的慢性肠道炎症性疾病，遗传易感性、免疫反应失调、环境因素改变、肠道微生物组成异常等均与IBD的发生和发展有关，其中肠黏膜通透性增加是IBD发病的重要机制，研究肠黏膜通透性改变的调控因素可能在IBD的病理生理机制中具有重要影响。

肠黏膜的炎性损伤程度直接导致肠黏膜通透性增加，在参与肠黏膜炎症过程的炎症介质中，DAMPs的作用越来越受到重视。DAMPs本质上是由于细胞或组织损伤而表达或释放的内源性应激蛋白，能刺激促炎细胞因子和趋化因子的释放，具有直接促炎作用。研究表明DAMPs(包括HMGB1、IL-1α、IL-33等)通过激活与先天免疫直接相关的固有层细胞诱导肠道炎症，可能在IBD中发挥作用，如细胞外HMGB1参与诱导肠上皮细胞自噬，增加黏附分子的表达，以及促炎细胞因子和趋化因子的分泌，IBD患者的固有层单核细胞中可以检测到高水平的IL-1α，与健康对照组相比，活动期UC患者肠黏膜IL-33 mRNA的表达显著增加。DAMP可能来源于不同的细胞内组分，包括细胞质、细胞核和线粒体，或者来源于细胞外基质，其中来源于线粒体的mtDNA是当前研究的热点。

线粒体由产生能量的α细菌进化，形成以真核细胞为基础的共生关系，与细菌有很多相似特征，其中最重要的是mtDNA与细菌DNA类似，含有大量非甲基化的CpG序列，在炎症及免疫反应中有重要作用。正常情况下，mtDNA主要在细胞内参与线粒体蛋白质的合成，创伤和细胞凋亡等可以引起mtDNA释放到细胞外环境，引起炎症反应。在Collins et al发现将mtDNA注射到小鼠关节内时可以诱导TNF-α表达增高并引起关节炎，证明了mtDNA的促炎症潜能。TLR9是一种高度保守的PRRs，在受到CpG-DNA刺激时，TLR9从内质网移位到内涵体和质膜识别配体并激活细胞炎症通路。因此，mtDNA直接通过激活TLR9来激发免疫和炎症反应，增加促炎细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β的表达。本研究表明mtDNA可增加TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子水平，可能与TLR9有关。mtDNA可通过cGAS-STING通路增加视网膜微血管内皮细胞中炎性细胞因子的表达，损伤视网膜微血管内皮细胞，破坏血视网膜屏障，可能引起视力障碍。富含CpG序列和TLR9配体的细菌DNA能够改变内皮细胞通透性，增加中性粒细胞与内皮细胞的黏附，并与两种细胞中黏附分子的上调有关。mtDNA可导致肺血管内皮细胞通透性改变，加重急性肺损伤。mtDNA在肠道炎症方面的研究较少。Hu et al研究表明mtDNA通过激活STING通路诱导肠道炎症反应。

本研究显示，IBD患者血浆和血小板mtDNA水平增加，并且与疾病的活动性和严重程度有关。这些增加的mtDNA在IBD发病过程中的具有作用以及是否通过影响肠黏膜上皮细胞通透性参与IBD发生的机制尚不清楚。因此，本研究用不同浓度的mtDNA处理Caco-2细胞单层，显示mtDNA能显著增加Caco-2细胞单层的通透性，表明mtDNA可破坏肠道黏膜上皮细胞屏障，增加肠黏膜通透性。mtDNA增加Caco-2细胞的TLR9 受体mRNA水平，促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18等增加，表明mtDNA可直接引起肠上皮细胞合成大量炎症介质，导致肠道炎症损伤反应。用TLR9特异性抑制剂ODN TTAGGG预处理可显著降低mtDNA引起的Caco-2细胞单层通透性的增加，降低TLR9受体mRNA水平和下游促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18水平，表明mtDNA增加肠黏膜通透性与TLR9信号通路有关。