易力 刘宏雷 郝增方 贾欣

肺癌是全球最常见的癌症，是目前死亡率最高的恶性肿瘤之一，并且是我国癌症导致死亡的首要原因[1,2]。多项研究结果表明，烟草、石棉和真菌毒素等环境污染物可以促进肺癌的发生发展[3-6]。我课题组前期研究发现灌胃黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFG1)可以诱发小鼠肺部慢性炎症，最终发生肺腺癌[7]。并发现在AFG1诱导的小鼠肺腺癌标本中，炎症细胞因子TNF-α和IL-6、SOD-2和EMT及侵袭相关指标均高表达，而且已经通过体外实验证明SOD-2介导了炎症细胞因子TNF-α诱导的肺腺癌细胞EMT和迁移[8]。本文旨在揭示人肺腺癌手术标本中TNF-α-SOD2-肺腺癌增殖之间的关系及SOD-2和肺腺癌患者生存预后的关系，为临床预测预后提供新的指标。

1 材料与方法

1.1 材料 选取河北医科大学第二医院病理科2009年1月至2014年12月诊断的肺腺癌石蜡标本共68例为肺腺癌组，术前未经过放疗或化疗。另取20例正常肺组织作为对照组。收集患者的临床病理资料，包括年龄、性别、分化程度及有无淋巴结转移等，并进行电话随访完善生存时间。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学方法:所选标本蜡块进行连续切片，厚度为 4 μm。免疫组化方法参照SP试剂盒(杭州四季青公司)，加一抗TNF-α(美国Cell Singaling公司)、SOD-2(美国Epitomics公司)、cyclinD1(美国Epitomics公司)和Survivin(美国Cell Singaling公司)，DAB试剂盒显色(购自福州迈新公司)，光学显微镜观察。

1.2.2 免疫组化结果判读:TNF-α、SOD-2和Survivin蛋白阳性的评定标准：细胞质内可见棕黄色或棕褐色颗粒。免疫组化染色结果评判标准为：每张切片随机选取5个高倍视野(40×)，光学显微镜下观察细胞着色程度，同时计数每个高倍视野中阳性细胞数所占的百分比进行评分：①阳性细胞数≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；②细胞阳性反应强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分，将①和②两者相乘得分结果≤4分判读为阴性，>4分判读为阳性。CyclinD1蛋白的评定标准：细胞核可见棕黄或棕褐色颗粒评定为阳性。免疫组织化学染色结果判断标准为：每张切片随机计数5个高倍视野(40×)，光学显微镜下观察细胞着色程度，按阳性细胞所占的百分比进行评判：阳性细胞<5%判定为阴性；阳性细胞≥5%判定为阳性。

2 结果

2.1 炎性细胞因子TNF-α、SOD-2和增殖相关蛋白Survivin、CyclinD1在人肺腺癌组织中的表达情况 TNF-α、SOD-2和Survivin阳性表达为细胞浆出现棕黄色或棕褐色颗粒。CyclinD1阳性表现为细胞核呈棕黄色。上述指标在肺腺癌标本中的部分病例为阳性，正常对照肺组织中可见少量阳性表达细胞。免疫组化结果显示，68例肺腺癌标本中TNF-α的阳性率为82.4%(56/68)，正常肺组织中只有2例阳性，阳性率为10%(2/20)(χ2=36.007，P=0.000)。SOD-2阳性标本有33例，阳性率为48.5%(33/68)，而正常肺组织中4例阳性(χ2=5.162，P=0.023)。增殖相关蛋白Survivin和CyclinD1在68例肺腺癌中，阳性例数分别为42例和34例，阳性率分别为61.8%和50.0%，和正常肺组织比较，有明显差异(χ2=36.007，P=0.000；χ2=7.769，P=0.005)。见图1，表1～4。

图1 2组TNF-α、SOD-2、Survivin 和CyclinD1蛋白的表达(免疫组×40)

表1 TNF-α在肺腺癌组织中的表达情况 例

表2 SOD-2在肺腺癌组织中的表达情况 例

表3 Survivin在肺腺癌组织中的表达情况 例

表4 CyclinD1在肺腺癌组织中的表达情况 例

2.2 肺腺癌中TNF-α与SOD-2的相关性分析 56例TNF-α蛋白表达阳性肺腺癌组织中，SOD-2同时为阳性的有31例，二者存在正相关关系(r=0.295，P=0.015)。见表5。

表5 肺腺癌组织中TNF-α和SOD-2表达的相关性 例

2.3 肺腺癌组织中SOD-2与增殖相关蛋白Survivin和CyclinD1的相关性分析 在33例SOD-2阳性表达的肺腺癌组织中，Survivin同时为阳性的有26例，而在35例SOD-2阴性的标本中，只有16例Survivin呈阳性，通过Spearman等级相关检验显示二者呈正相关关系(r=0.340，P=0.004)。同样，在33例SOD-2阳性表达的标本中，CyclinD1阳性表达例数为27例，35例SOD-2阴性表达的标本中，CyclinD1阳性例数为7例，二者呈明显正相关关系(r=0.618，P=0.000)。见表6、7。

表6 肺腺癌组织中SOD-2和Survivin表达的相关性 例

表7 肺腺癌组织中SOD-2和CyclinD1表达的相关性 例

2.4 肺腺癌患者的临床病理特征和SOD-2对生存预后影响的分析

2.4.1 分析肺腺癌患者的临床病理特征:对68例肺腺癌患者进行电话随访，随访时间5个月到60个月，平均26.3个月。其中死亡47例，12例健在，9例失访，失访率为13.2%。患者男女比例为0.89∶1(32/36)；平均年龄60.0岁，>50岁患者为≤50岁患者的4.67倍(56/12)；低分化患者与高分化、中分化患者的人数之比为0.48∶1(22/46)；患者有淋巴结转移与无淋巴结转移的人数之比为0.66(27/41)。见表8。

2.4.2 肺腺癌患者SOD-2表达与临床病理特征的关系:统计学结果显示，在27例有淋巴结转移的肺腺癌标本中，20例存在SOD-2蛋白阳性表达(χ2=11.698，P=0.001)，结果提示SOD-2阳性表达和肺腺癌淋巴结转移有关。但是SOD-2的表达与患者性别、年龄及癌组织分化程度均无相关性(P>0.05)。见表8。

表8 肺腺癌患者SOD-2表达和临床病理特征之间的关系 例

2.4.3 肺腺癌患者SOD-2表达和临床病理特征对生存时间的影响:Kaplan-Meier生存曲线显示：肺腺癌患者淋巴结转移及癌组织分化程度和生存时间相关(χ2=14.227，P=0.000；χ2=4.184，P=0.041)，而患者的年龄及性别和其生存时间无相关性(χ2=3.694，P=0.055；χ2=0.025，P=0.874)；SOD-2表达和患者生存时间也存在相关性，高表达SOD-2组患者的生存时间明显低于低表达SOD-2患者(χ2=5.766，P=0.016)。见图2。

图2 肺腺癌患者临床特征和SOD-2的生存曲线

3 讨论

肺癌是目前全球最具挑战性的健康问题之一，其死亡率比乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌加起来还要多[9]，是我国目前恶性肿瘤导致死亡的首要原因[1,2]。肺癌分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌，其中NSCLC占到85%，而肺腺癌又是NSCLC最常见的肺癌亚型。多项研究结果显示，环境污染物如烟草、汽车尾气及真菌毒素等都可以促进肺癌的发生发展[3-6]。我组前期研究结果显示：灌胃AFG1可以诱发小鼠肺部慢性炎症，并最终致肺腺癌[7]。并发现在AFG1诱导小鼠肺腺癌组织中炎症细胞因子TNF-α表达明显升高，同时SOD-2蛋白表达也升高[8]。恶性肿瘤的特征就是肿瘤细胞的失控性增殖，在AFG1诱发的小鼠肺腺癌标本中，我们发现CyclinD1、Survivin、PCNA、BCL-XL这些增殖及抗凋亡相关指标均表达升高，说明肺腺癌细胞增殖增加。因此，本研究选取人肺腺癌手术标本，免疫组织化学方法检测炎症细胞因子TNF-α、SOD-2及增殖相关蛋白CyclinD1和Survivin的表达。结果发现TNF-α、SOD-2、Survivin和CyclinD1蛋白在肺腺癌组织中表达均升高，阳性率分别为82.4%、48.5%、50.0%和61.8%。

SOD-2是一种抗氧化金属酶，在机体的氧化与抗氧化平衡关系中发挥重要的作用，与很多疾病的发生发展有关。SOD-2不仅参与肿瘤的浸润转移，还和肿瘤细胞的增殖密切相关，但SOD-2的表达在不同类型的肿瘤中对肿瘤细胞增殖的作用并不一致，其既是一个抑癌基因，又是一个促癌基因[10]。Jeon等[11]发现蛋白激酶C诱导的SOD-2过表达抑制肿瘤细胞增殖。在具有侵袭性甲状腺滤泡细胞癌小鼠中，SOD-2的过度表达降低了肿瘤的增殖[12]。Guo等[13]的研究指出，细胞穿透肽TAT处理后的SOD-2刺激对肝癌细胞的增殖有明显的抑制作用。也有不同的文献报道，Hemachandra等[14]发现SOD-2在卵巢透明细胞癌中高表达，而且随着SOD-2表达的降低，细胞的增殖及迁移能力显著降低。我组前期通过体外细胞培养试验发现AFG1可以诱导炎症细胞因子TNF-α表达升高，通过促进SOD-2高表达介导肺腺癌细胞发生EMT和促进侵袭[8]。为进一步探讨炎症细胞因子TNF-α-SOD2-肺腺癌细胞增殖之间的相互关系，我们通过Spearman等级相关检验分析发现，TNF-α和SOD-2蛋白表达呈正相关相关关系；SOD-2和增殖相关蛋白CyclinD1、Survivin的蛋白表达同样呈正相关关系，综合以上实验结果进一步证实：炎症细胞因子TNF-α通过诱导SOD-2表达，促进了肺腺癌细胞的增殖。

部分研究认为，SOD2和肿瘤的进展预后密切相关，并且可以作为预测预后的独立指标。在人类口腔鳞状细胞癌，尤其是中分化或低分化癌患者和早期颊黏膜癌患者中，SOD2高表达与好的生存率密切相关[15]。Chang等[16]在腺样囊性癌中的研究中发现，SOD-2表达上调与远处转移、总生存期和无病生存期降低有关。Ding等[17]使用定量蛋白质组学分析，检测15例肝细胞癌患者和15例健康对照者唾液样本之间的蛋白表达差异，结果发现肝细胞癌患者SOD-2表达升高，提示SOD-2可能成为检测肝细胞癌的潜在唾液生物标志物。因此，我们通过回顾性研究判断SOD-2蛋白表达和肺腺癌患者临床病理学意义及与生存时间的关系。结果发现，68例肺腺癌标本中有27例有淋巴结转移，这27例淋巴结转移病例中有20例SOD-2蛋白阳性表达，提示SOD-2表达和肺腺癌淋巴结转移有关，SOD-2高表达肺腺癌患者更容易发生淋巴结转移。但是SOD-2蛋白表达与患者性别、年龄及肿瘤分化程度均无相关性。我们又通过Kaplan-Meier生存曲线分析SOD-2蛋白表达与患者生存时间的关系，结果显示SOD-2高表达组患者的生存时间明显低于低表达组，提示我们SOD-2高表达是肺腺癌患者不良预后的独立因素。

综上所述，我们认为炎症细胞因子TNF-α介导的SOD-2表达升高，可能诱导肺腺癌细胞增殖。SOD-2高表达和患者的不良生存预后相关，可以作为肺腺癌患者预测预后的独立指标。