马琼艳张长城杨 圆张 艳吴 杰袁 丁赵海霞

（三峡大学医学院，湖北 宜昌443002）

随着社会经济的高速发展和生活环境的变化，人们生育观念发生转变，男性平均生育年龄不断提高，但临床研究显示，随着年龄增加睾丸生精功能逐渐衰退［1］。睾丸支持细胞与精子发生密切相关，而由相邻支持细胞组成的紧密连接对生精细胞移行有重要作用，衰老可致睾丸支持细胞功能衰退和紧密连接损伤，造成睾丸生精功能障碍［2］。研究显示，雄性大鼠缺 失 Occludin（闭锁蛋白）或Claudin⁃11（紧密连接蛋白）基因［3］，不能形成完整的紧密连接，导致生精功能障碍；在睾丸支持细胞中，p38MAPK 可将细胞外信号转移至细胞内，与靶基因MMP⁃9 启动子结合，MMP⁃9 蛋白表达增加，从而降解紧密连接蛋白，破坏血睾屏障完整性［4］。因此，抑制衰老睾丸支持细胞p38MAPK／MMP⁃9 通路活化，可能是减轻衰老大鼠睾丸支持细胞紧密连接损伤的重要措施之一。

五子衍宗方是传统补肾生精的代表方，由覆盆子、枸杞子、车前子、菟丝子、五味子5种中药组成，具有调节支持细胞功能、改善睾丸生精功能等药理作用，可改善男性不育症患者精液质量［5］，能通过改善支持细胞紧密连接超微结构来显著增加ZO⁃1 和Occludin 蛋白表达，进而改善雷公藤多苷所致小鼠生精功能障碍［6］，还可通过下调p⁃p38MAPK 蛋白表达来改善环磷酰胺所致大鼠睾丸生精功能障碍［7］。方中枸杞多糖可通过降低血管内皮细胞MMP⁃9 活性，上调ZO⁃1、Occludin 蛋白表达，减轻细胞损伤［8］，但该方能否改善衰老大鼠睾丸支持细胞紧密连接损伤，机制是否与调节p38MAPK／MMP⁃9 通路相关尚不明确。因此，本实验从改善衰老睾丸支持细胞紧密连接功能的角度，探讨五子衍宗方改善衰老大鼠睾丸生精功能障碍的机制。

1 材料

1.1 动物 30 只2 月龄SPF 级雄性SD 大鼠喂养至16 月龄，另购买10 只2 月龄SPF 级雄性SD 大鼠，均购买并分笼饲养于三峡大学实验动物中心动物房，动物生产许可证号SCXK（鄂）2012⁃0001，自由饮水进食，相对湿度（60±5）%，温度（22±3）℃，12 h 昼夜交替环境。

1.2 试剂与药物 五味子（批号15080702）、菟丝 子（批号15061901）、车前子（批号15063002）、枸杞子（批号15083002）、覆盆子（批号15071702）均购于宜昌市中医医院，经三峡大学何毓敏博士鉴定为正品，并根据2015年版《中国药典》 五子衍宗丸配方，称取枸杞子400 g、菟丝子400 g、车前子100 g、覆盆子100 g、五味子50 g，充分混匀后打成细粉末，30 g 低剂量（1 g／kg）饲料中加入0.8 g 药物，30 g 高剂量（4 g／kg）饲料中加入3.2 g 药物，送往饲料厂加工。β⁃actin（货号GB11001）、ZO⁃1（货号21773⁃1⁃AP）购于武汉谷歌生物技术有限公司；Claudin⁃11（货号ab53041）购于英国 Abcam 公 司；Ocludin（货号sc⁃5562）购于美国Santa Cruz 公司；SOX⁃9（货号AB5535）购于美国Millipore 公司；MMP⁃9（货号10375⁃2⁃AP）、p⁃p38MAPK（货号530056）购于美国ZenBio 公司；山羊抗兔二抗购于武汉科瑞生物有限公司；Alexa Fluor 594 驴抗兔IgG（H＋L）（货号140019）、Alexa Fluor 488 驴抗兔IgG（H＋L）（货号140422）购于美国Jackson Immuno Research 公司；ECL 显影液购于武汉谷歌生物科技公司。

1.3 仪器 Power Pas Basic200 Western blot 电泳仪购于美国Bio⁃Rad 公司；A1R＋激光共聚焦显微镜购于日本Nikon 公司；IX53 倒置光学显微镜购于日本Olympus 公司；TP 102 自动脱水机、EG 1150C 超薄切片机、EG 1150H 石蜡包埋机购于德国Leica 公司。

2 方法

2.1 分组与给药 30 只大鼠随机分为衰老模型组、五子衍宗方低剂量组（1 g／kg）、五子衍宗方高剂量组（4 g／kg），另取2 月龄SD 雄性大鼠作为青年对照组，每组10 只。依据2015年版《中国药典》 五子衍宗丸的成人日服用量，通过大鼠、成人体质量面积换算，确定低、高剂量组大鼠分别给予1、4 g／kg 含药饲料喂养，青年对照组、衰老模型组大鼠给予普通饲料喂养，给药4个月后麻醉处死大鼠，取出睾丸组织备用。

2.2 睾丸组织形态变化观察 取各组大鼠睾丸组织石蜡切片，常规脱蜡，HE 染色，透明，晾干，中性树脂封片，置于光学显微镜下观察其形态变化。去除睾丸组织病变和HE 染色异常编号后，每组取7～8个样本，在光镜下取40 倍图片6～7 张，采用Image J 软件测定每个生精小管的生精上皮厚度和生精小管直径，计数200个以上者，取平均值。

2.3 睾丸支持细胞紧密连接超微结构观察 取经4%多聚甲醛灌注固定的大鼠睾丸组织，切成薄片状后置于2.5%戊二醛固定液中固定，PBS 漂洗3次，1%锇酸固定液中固定2 h，PBS 漂洗3 次，组织梯度脱水（50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、无水乙醇15 min、无水乙醇＋丙酮溶液和丙酮溶液中各15 min），置于丙酮＋环氧树脂包埋剂（1∶1）中，烘烤5 h 使丙酮挥发，再置于包埋盒中，放到60 ℃烘箱中使包埋剂充分固化，置于超薄切片机上进行超薄切片，醋酸铀、枸橼酸铝双重染色后在电镜下观察支持细胞紧密连接超微结构变化。

2.4 睾丸支持细胞紧密连接蛋白表达检测 称取20～30 mg 大鼠睾丸组织，按RIPA 裂解液与PMSF 100∶1 的比例提取总蛋白，BCA 法对蛋白进行定量，在上清液中按4∶1 比例加入蛋白上样缓冲液，置于沸水浴中加热变性10 min，进行电泳和转膜，5%脱脂牛奶封闭，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，超敏ECL 显影液进行显影，Image Pro Plus 软件进行分析，以β⁃actin 为内参，计算各蛋白条带与内参照的灰度比值。剔除病变组织编号样本后，将每组剩余7～8个样本进行检测，重复3次，取平均值。

2.5 睾丸支持细胞紧密连接蛋白ZO⁃1、Occludin、Claudin⁃11、p⁃p38MAPK 表达和定位检测 取大鼠睾丸组织石蜡切片，常规脱蜡，高压修复10 min，待冷却完全后滴加5% BSA 封闭组织60～90 min，再滴加0.03% Triton X⁃100＋PBS 稀释的一抗，4 ℃下孵育过夜，滴加相应二抗，室温下孵育1 h，DAPI 染核10 min，滴加适量抗荧光淬灭封片剂封片，在激光共聚焦显微镜下观察各组样本目的蛋白表达与定位，拍照取图。剔除病变组织样本后，每组取5个进行实验，每个随机取400 倍下10个视野，观察大约200个睾丸支持细胞紧密连接相关蛋白的表达情况，通过Image Pro Plus 软件进行相对荧光强度分析，重复3 次，取平均值。

2.6 统计学分析 通过Graphpad Prism7.0、Image pro plus 6.0 软件进行处理，数据以（）表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 五子衍宗方对衰老大鼠睾丸组织形态的影响 如图1 所示，青年对照组大鼠睾丸组织形态结构良好；与青年对照组比较，衰老模型组大鼠生精小管间缝隙增大，生精细胞数量减少、排列紊乱；五子衍宗方组可改善衰老大鼠生精小管间隙，增加生精细胞数量。与青年对照组比较，衰老模型组大鼠睾丸生精上皮厚度和生精小管直径下调（P＜0.01），五子衍宗方高剂量可上调两者（P＜0.05，P＜0.01）。

图1 五子衍宗方对衰老大鼠睾丸组织形态的影响（， n＝7）Fig.1 Effects of Wuziyanzong Recipe on the morphologies of testicular tissues of aging rats（， n＝7）

3.2 五子衍宗方对衰老大鼠睾丸支持细胞紧密连接超微结构的影响 如图2 所示，青年对照组大鼠睾丸支持细胞紧密连接完整，边界清晰；与青年对照组比较，衰老模型组大鼠睾丸支持细胞间紧密连接缝隙增大，连接松散，紧密连接断裂，边界不清晰；与衰老模型组比较，五子衍宗方组可缩小紧密连接间缝隙，减少紧密连接断裂，保持紧密连接边界清晰，进而改善衰老大鼠睾丸支持细胞紧密连接超微结构。

图2 五子衍宗方对衰老大鼠睾丸支持细胞紧密连接超微结构的影响Fig.2 Effects of Wuziyanzong Recipe on the ultrastructure of Sertoli cells tight junctions in aging rats

3.3 五子衍宗方对衰老大鼠睾丸支持细胞紧密连接蛋白ZO⁃1、Occludin 表达的影响 如图3 所示，与青年对照组比较，衰老模型组大鼠睾丸支持细胞ZO⁃1、Occludin 表达降低（P＜0.01），而五子衍宗方组可上调两者表达（P＜0.01）。

图3 五子衍宗方对衰老大鼠睾丸支持细胞紧密连接蛋白ZO⁃1、Occludin 表达的影响（， n＝3）Fig.3 Effects of Wuziyanzong Recipe on the expressions of ZO⁃1 and Occludin in Sertoli cells in aging rats（， n＝3）

3.4 五子衍宗方对衰老大鼠睾丸支持细胞紧密连接蛋白ZO⁃1 表达和定位的影响 如图4 所示，青年对照组大鼠睾丸组织中ZO⁃1 主要呈线状分布于支持细胞周围；与青年对照组比较，衰老模型组大鼠ZO⁃1 表达降低（P＜0.01），仅在支持细胞周围呈点状分布，而五子衍宗方高剂量可上调其表达（P＜0.05）。

图4 五子衍宗方对衰老大鼠睾丸支持细胞紧密连接蛋白ZO⁃1 表达和定位的影响（， n＝4）Fig.4 Effects of Wuziyanzong Recipe on the expression and localization of ZO⁃1 in Sertoli cells in aging rats（， n＝4）

3.5 五子衍宗方对衰老大鼠睾丸支持细胞紧密连接蛋白Occludin 表达和定位的影响 如图5 所示，青年对照组大鼠睾丸组织中Occludin 呈线性表达于支持细胞之间和支持细胞与生精细胞间；与青年对照组比较，衰老模型组大鼠睾丸支持细胞紧密连接蛋白Occludin 表达下调（P＜0.01），而五子衍宗方可上调其表达（P＜0.01）。

图5 五子衍宗方对衰老大鼠睾丸支持细胞紧密连接蛋白Occludin 表达和定位的影响（， n＝4）Fig.5 Effects of Wuziyanzong Recipe on the expression and localization of Occludin in Sertoli cells in aging rats（，n＝4）

3.6 五子衍宗方对衰老大鼠睾丸支持细胞紧密连接蛋白Claudin⁃11 表达和定位的影响 如图6 所示，青年对照组大鼠睾丸组织中Claudin⁃11 呈线状分布于支持细胞周围；与青年对照组比较，衰老模型组大鼠睾丸支持细胞紧密连接蛋白Claudin⁃11 表达下调（P＜0.01），而五子衍宗方高剂量可上调其表达（P＜0.05）。

图6 五子衍宗方对衰老大鼠支持细胞紧密连接蛋白Claudin⁃11 表达和定位的影响（， n＝4）Fig.6 Effects of Wuziyanzong Recipe on the expression and localization of Claudin⁃11 in Sertoli cells in aging rats（， n＝4）

3.7 五子衍宗方对衰老大鼠睾丸支持细胞p⁃p38MAPK 表达和定位的影响 如图7 所示，青年对照组大鼠睾丸支持细胞核内p⁃p38MAPK 仅有少量表达；与青年对照组比较，衰老模型组大鼠支持细胞p⁃p38MAPK 表达升高（P＜0.01），而五子衍宗方可降低其表达（P＜0.01）。

图7 五子衍宗方对衰老大鼠睾丸支持细胞p⁃p38MAPK 表达和定位的影响（， n＝3）Fig.7 Effects of Wuziyanzong Recipe on the expression and localization of p⁃p38MAPK in Sertoli cells in aging rats（， n＝3）

3.8 五子衍宗方对衰老大鼠睾丸MMP⁃9 和Occludin 表达和共定位的影响如图8 所示，MMP⁃9 定位于生精细胞与支持细胞间和生精细胞与生精细胞间；与青年对照组比较，衰老模型组大鼠MMP⁃9 表达增加，而且MMP⁃9 与Occludin 共定位增多；五子衍宗方组可下调其表达，降低两者共定位表达。

图8 五子衍宗方对衰老大鼠睾丸组织MMP⁃9 和Occludin 表达和共定位的影响Fig.8 Effects of Wuziyanzong Recipe on the expression and co⁃localization of MMP⁃9 and Occludin in testicular tissue in aging rats

4 讨论

随着年龄的增长，睾丸组织在形态结构和功能上均会出现退行性变化，进而导致生精功能衰退［2］。研究发现，五子衍宗方可通过减轻生精小管萎缩和各级生精细胞脱落，改善睾丸组织形态结构，从而减轻醋酸棉酚对大鼠睾丸生殖功能的损伤［9］。本课题组前期研究发现，五子衍宗方可抑制生精细胞凋亡，从而改善衰老大鼠睾丸组织形态结构［10］。本研究发现，五子衍宗方可改善衰老大鼠睾丸组织的形态结构，显著上调生精小管直径和生精上皮的厚度。

血睾屏障是存在于睾丸支持细胞之间由连接复合体组成的特殊结构，为精子发生提供良好的生精微环境。已知紧密连接是血睾屏障的重要组成部分，主要由ZO 家族、Claudin 和Occludin 家族组成，在精子发生过程中精母细胞须穿过紧密连接进入近腔室，才能进一步分化为成熟的精子；若紧密连接功能被破坏，血睾屏障的通透性异常，精母细胞不能正常进入近腔室进行发育，进而导致生精功能障碍。我们前期研究显示，随着年龄的增长大鼠睾丸组织内Occludin 蛋白表达逐渐下调，血睾屏障被破坏，生精功能受损［11］；另有研究发现，当支持细胞Claudin⁃11 和Occludin 基因沉默后，支持细胞不能形成完整的紧密连接［3］。已知ZO⁃1 是紧密连接的主要衔接蛋白，与Occludin 和Claudin⁃11 定位于生精小管基底部，共同形成紧密连接。SOX9基因可在哺乳动物睾丸支持细胞中稳定表达，可将其作为支持细胞的特异性标记物［12］。研究显示，五子衍宗方可通过改善支持细胞骨架蛋白波形蛋白的表达，改善支持细胞功能，进而减轻雷公藤多苷对大鼠的生精功能损伤［13］；还可通过维持大鼠睾丸支持细胞紧密连接功能，减轻支持细胞凋亡，进而提高支持细胞热应激的能力［14］。本研究发现，五子衍宗方可改善衰老大鼠睾丸支持细胞紧密连接超微结构，显著上调衰老大鼠睾丸支持细胞紧密连接蛋白ZO⁃1、Occludin 和Claudin⁃11 的表达。以上结果证实，五子衍宗方可通过改善衰老支持细胞紧密连接损伤，延缓衰老大鼠睾丸生精功能衰退。

p38MAPK／MMP⁃9 通路与支持细胞紧密连接损伤相关［15］。研究显示，脱敏煎通过下调 p⁃p38MAPK 蛋白表达，上调Occludin 蛋白表达，减轻TGF⁃β1 诱导的睾丸支持细胞紧密连接损伤［16］；黄芪甲苷可通过下调p⁃p38MAPK 蛋白表达，上调Occludin、ZO⁃1 和Claudin⁃11 的表达，维持支持细胞紧密连接的完整性，进而改善镉所致大鼠睾丸生殖毒性［17］。加味五子 衍宗方可 通过抑制 p⁃p38MAPK 蛋白表达减轻β 淀粉样蛋白诱导的海马神经元损伤［18］。另有研究显示，在脂多糖诱导脑血管内皮细胞损伤模型中，p38MAPK和MMP⁃9 mRNA 表达上调，Occludin和ZO⁃1 mRNA 表达下调，在加入MMP⁃9 抑制剂后，可上调Occludin表达［19］。本研究发现，五子衍宗方可下调衰老大鼠睾丸支持细胞p⁃p38MAPK 蛋白表达，下调睾丸组织MMP⁃9 蛋白表达，降低MMP⁃9 和Occludin 共定位的表达。这提示五子衍宗方可能通过抑制p38MAPK／MMP⁃9 通路活化，从而减轻睾丸支持细胞紧密连接损伤，延缓衰老大鼠睾丸生精功能衰退。

综上所述，五子衍宗方可通过抑制p38MAPK／MMP⁃9 通路的活化，减轻衰老大鼠睾丸支持细胞紧密连接损伤，进而延缓衰老大鼠睾丸生精功能衰退。以期为五子衍宗方治疗衰老睾丸生精功能衰退提供了新的研究思路。