曾爱英 廖星 戴木森

（1 福建医科大学省立临床医学院 福州350001；2 福建省立医院急诊内科 福州350001）

铜绿假单胞菌（Pseudomonas Aeruginosa, Pa）是一种革兰阴性非发酵杆菌，是院内感染最常见的细菌之一，常见于烧伤后的继发感染、尿路感染、血流感染、囊性支气管扩张、二重感染及免疫抑制患者的继发感染，位居临床非发酵菌检出率的首位[1~2]。 随着抗生素的滥用，多重耐药菌株不断出现，而导致耐药产生的一个重要机制就是生物被膜（BF）的形成。研究发现磷霉素（FOS）可破坏形成的BF，与其他抗生素联合使用时对BF 内细菌有协同杀菌作用[3]。本研究探讨FOS 对Pa 的BF 的影响及对美罗培南（MEM）的增效作用，为临床多重耐药Pa 感染的治疗提供参考。 现报道如下：

1 材料与方法

1.1 菌株来源 从临床收集Pa 菌株（编号为12078）及质控菌株ATCC29953 均由福建省立医院微生物检验中心鉴定及提供。

1.2 药物与试剂 FOS 为标准品，购于中国药品生物制品检定所；MEM 标准品，购于中国食品药品检定研究院。

1.3 实验方法

1.3.1 最 低 抑 菌 浓 度 （Minimal Inhibitory Concentration, MIC）的测定 参照美国2014 CLSI 微量肉汤稀释法[4]测定临床分离Pa12078，以肉眼观察无细菌生长的最低药物质量浓度为MIC。ATCC29953 作为质量控制菌株。

1.3.2 BF 的制备 将Pa 复壮于无菌LB 琼脂平板上， 过夜后挑取单个菌落接种于盛有50 ml 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）的烧瓶中，置于恒温摇床（37℃，180 r/min）过夜，次日用新鲜TSB 过夜培养菌液稀释成 OD600=0.2（菌液浓度约为 5.0×108CFU/L）。 将无菌14 mm 的载体分别放入无菌24 孔板中， 随后每孔加入2 ml 稀释好的菌液， 放入37℃恒温培养箱培养， 隔日更换培养液。 7 d 载体表面形成成熟BF。

1.3.3 结晶紫染色法半定量BF Pa 的BF 载体经0.9%的无菌氯化钠溶液漂洗3 遍，晾干后放入另一24 孔板中，每孔加入0.1%的结晶紫染液1 ml，染色15 min，再用0.9%氯化钠溶液漂洗至清亮，然后晾干载体。 取1 ml 95%乙醇溶解BF 上的结晶紫5 min。 取 200 μl 加入 96 孔板，多功能酶标仪 570 nm波长处测定吸光度值。

1.3.4 实验分组及处理 分为空白对照组、FOS组、MEM 组、FOS+MEM 组。 FOS 及 MEM 的浓度分别为 64 μg/ml 和 16 μg/ml。 于建模第 7 天，用0.9%氯化钠溶液将附有BF 的载体轻轻漂洗， 去除浮游菌， 按实验分组然后分别加入FOS、MEM、FOS+MEM，每孔2 ml，37℃恒温培养。 各组分别于药物作用4 h、8 h、24 h 后取出载体，再次用0.9%氯化钠溶液漂洗载体，后将载体置于盛有2 ml 0.9%氯化钠溶液的试管中，用漩涡震荡仪震荡试管，使细菌脱落至氯化钠溶液中形成菌悬液， 采用连续稀释进行菌落计数，计数每毫升菌悬液的活菌数（CFU/ml），结果用（）表示，每个时间点每个实验组计数4份载体，每次重复测量3 次后取平均值。

1.4 统计学分析 采用SPSS19.0 统计学软件包进行单因素方差分析，检验水准为α=0.05。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MIC 测 定结果 FOS 及 MEM 对 Pa12078 的MIC 分别为 128 μg/ml 及 32 μg/ml。

2.2 结晶紫半定量结果 空白对照组24 h 吸光度值无明显变化（P＞0.05）。 MEM 组 4 h、8 h、24 h 时吸光度值与空白对照组比较， 差异无统计学意义（P＞0.05）。 FOS 组24 h 时吸光度值低于空白对照组（P＜0.05）。 FOS+MEM 组 8 h 时吸光度值开始比空白对照组低（P＜0.01）。 见表 1。

表1 不同药物作用后半定量结果（）

表1 不同药物作用后半定量结果（）

注：与空白对照组同时间点比较，*P＜0.05，与对照组比较，#P＜0.01。

组别 n 4 h 8 h 24 h空白对照组FOS 组MEM 组FOS+MEM 组4444 2.46±0.19 2.20±0.17 2.41±0.19 2.11±0.30 2.26±0.16 1.93±0.44 2.14±0.42 1.50±0.33#2.20±0.24 1.48±0.43*2.18±0.26 0.82±0.10#

2.3 BF 经FOS、MEM 及二者联合应用后活菌数变化 空白对照组BF 内活菌数24 h 无明显变化（P＞0.05）。 FOX 组、MEM 组 4 h、8 h、24 h 时 BF 内活菌数与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 FOS+MEM 联合用药组 4 h、8 h、24 h 时 BF内活菌数均比空白对照组少（P＜0.01）。 见表2。

表2 不同药物作用后活菌数（lgCFU/ml，）

表2 不同药物作用后活菌数（lgCFU/ml，）

注：与空白对照组同时间点比较，*P＜0.01。

组别 n 4 h 8 h 24 h空白对照组FOS 组MEM 组FOS+MEM 组4444 7.78±0.05 7.74±0.06 7.70±0.08 7.06±0.06*7.54±0.37 7.39±0.31 7.51±0.31 6.36±0.24*7.51±0.47 7.26±0.40 7.28±0.43 6.01±0.37*

3 讨论

近年研究发现抗生素的耐药、院内感染都与细菌BF 形成有关。 Pa 是院内感染患者标本中分离率较高的一种病原菌，极易形成BF。 BF 的形成使Pa能防御吞噬细胞的作用，逃避宿主免疫反应，导致耐药，为临床治疗带来严峻挑战[5]。 碳青霉烯类药物的广泛使用、重症监护病房治疗和机械通气均可引起Pa 耐药[6]。MEM 是临床治疗Pa 的常用抗生素之一，但Pa 对 MEM 耐药率也趋于增长[7]。 Pa 对碳青霉烯类耐药的一个重要原因是细菌外层细胞壁的特异外膜通道蛋白丢失，造成细胞壁低渗透性，使碳青酶烯类抗生素无法进入细菌体内， 而细菌在BF 屏蔽下可逃避抗菌药物杀伤作用，从而导致细菌耐药[8]，抗感染治疗失败。 FOS 是一种磷酸类化学合成的广谱抗生素，但抗菌活性不大，临床常用于敏感菌引起的轻中度感染。 其抗菌作用机制是通过抑制磷酸烯醇丙酮酸合成酶阻断肽聚糖合成的第一步， 从而干扰细菌细胞壁合成。 有研究表明，磷霉素与喹诺酮类、β 内酰胺类药物联合应用， 在抗BF 和多重耐药细菌方面表现出了协同效应[9]。

本实验结果显示，应用FOS 24 h 后Pa 的BF 吸光度值小于空白对照组（P＜0.05），说明FOS 能破坏Pa 的BF；而MEM 单独应用后吸光度值、活菌计数与空白对照组相比， 差异均无统计学意义（P＞0.05），说明 MEM 对 Pa 的 BF 及 BF 内活菌无明显作用； 当两药合用后吸光度值于8 h 起即低于空白对照组（P＜0.01），活菌计数于4 h 起即低于空白对照组（P＜0.01），存活细菌数明显减少，推测两药合用后可能加速了Pa 的BF 的破坏， 从而增强了MEM 的渗透及对BF 内Pa 的杀灭， 显示出了协同杀菌作用。以上研究结果说明Pa 对MEM 耐药的机制可能是BF 的屏障作用限制了MEM 进入BF 内，使得BF 内MEM 达不到有效杀菌浓度， 从而无法发挥杀菌作用，而FOS 具有破坏耐药Pa 的BF 或抑制其形成的作用。两者联用对耐碳青霉烯类Pa 能发挥增效协同作用。 但其具体效果尚需动物实验及体内试验加以证实。