刘 颖，柴丽娟，黄菊阳，王 琴，宋 蕾，周 昆*，李云章*

(1.内蒙古农业大学 兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.天津中医药大学 中医药研究院 天津市中药药理重点实验室，天津 300193)

随着人们生活水平的提高，宠物的饲养条件及医疗保健程度有了很大的提升，宠物平均寿命也随之增长，宠物老年病和慢性病日渐涌现，其中就包括骨质疏松等骨骼疾病，常表现为老年动物的骨折、椎体变形、骨痛等。

淫羊藿(Epimediumbrevicornu)，又名仙灵脾、三枝九叶草，是传统的补肾壮骨中药，能补肾阳、强筋骨、祛风湿[1]。近期研究发现，淫羊藿可提升软骨内成骨，增加骨痂和骨密度，加快骨折愈合[2]；淫羊藿苷通过抑制成骨细胞表达核转录因子(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)诱导RAW264.7细胞，从而减少破骨细胞的分化[3]。淫羊藿中朝藿定A、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ、朝藿定B、朝藿定C等黄酮类成分含量较高并具有较强生理活性[4]。故本试验以正常小鼠骨髓单核细胞诱导形成的破骨细胞和去势诱导的骨质疏松雄性小鼠为模型，明确朝藿定A对破骨细胞及骨质疏松雄性小鼠的作用。目前，去势小鼠模型是比较公认的骨丢失动物模型，可以很好的模拟老年激素缺乏所引起的骨丢失，因而体内试验采用去睾丸的方法造模进行骨质疏松症的基础研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物4～6周C57BL/6J 小鼠，SPF级，用于采集骨髓细胞；72只雄性ICR小鼠，体质量约20 g，SPF级，用于构建骨质疏松模型。小鼠购买于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证编号：SCXK(京)2016-0004。动物饲养于天津中医药大学实验动物房。

1.2 主要试剂α-MEM培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青链霉素混合液、trypsin-0.25%EDTA(Gibco)；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)&TRACP染色试剂盒(TaKaRa)；朝藿定A(普菲德)；磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)、EDTA-Na2(索莱宝)；二甲基亚砜(Amresco)；依普拉芬胶囊(Enzymatic Therapy)；骨保护素(OPG)ELSIA 试剂盒(Abcam)；Ⅰ型前胶原交联C末端肽(CTXⅠ)ELSIA 试剂盒(USCN)；雌二醇(E2)(Sigma)。

1.3 主要仪器多功能读板机(Felex station 3，MD)；超声破碎仪(VCX 130，Sonics)；倒置荧光显微镜(TE300，Nikon)；超净工作台(苏净安泰)；CO2培养箱(Thermo)；小型台式离心机、台式冷冻离心机(Beckman)；气浴摇床(S1500，Stuart)；天平(Sartorius)；VivaCT 40骨密度仪(Scanco Medical AG)。

1.4 细胞试验

1.4.1小鼠骨髓单核细胞的分离与培养 拉颈法处死C57BL/6J小鼠，于75%酒精中浸泡消毒5 min，在超净台分离小鼠后肢长骨，去除骨表面软组织和骨骺，置入盛有PBS(1%双抗)的玻璃皿中。用针筒吸取完全培养基(90%α-MEM，10%FBS，1%青链霉素，简称全培)，反复冲洗骨髓腔和骨内表面，直至骨壁变白。骨髓悬液用70μm细胞筛过滤，用 ficoll分离液分离出单核细胞，将细胞悬液均匀接种至25 cm2培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。

1.4.2破骨细胞TRACP染色 将细胞悬液用含20 μg/L 巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)的完全培养基调节浓度至3×105个/mL，接种到96孔板。培养48 h后，吸去培基去除未贴壁细胞，加入含20 μg/L M-CSF和50 μg/L RANKL的α-MEM含药培基进行培养。设朝藿定A给药浓度分别为0.01，0.10，1.00 μmol/L(记为AL、AM、AH)；阳性对照给予E2，浓度为0.10 μmol/L；对照(CON)和模型(MO)给予0.1%DMSO。置于37℃、5%CO2培养箱中培养，每3～4 d 换液，培养7 d后，吸掉96孔板内的培养液，用PBS冲洗3遍，用TRACP染色试剂盒对细胞进行染色。

1.4.3破骨细胞骨吸收能力测定 将无菌处理过的骨切片放入96孔板中，而后将细胞悬液以3×105个/mL种入，200 μL/孔。2 d后PBS液洗涤除去未贴壁细胞，加入含20 μg/L M-CSF和50 μg/L RANKL的α-MEM含药培基进行培养。设朝藿定A给药浓度分别为0.01，0.10，1.00 μmol/L(记为AL、AM、AH)；阳性对照给予E2，浓度为0.1 μmol/L；对照(CON)和模型(MO)给予0.1%DMSO。细胞每3 d换液1次，于14 d后细胞终止培养，取出骨薄片，进行甲苯胺蓝染色。

1.5 动物试验

1.5.1动物造模、分组及给药 采用随机数字法，从72只雄性ICR小鼠中抽取12只作为空白对照组(Con)；其余小鼠行睾丸切除术造模。采用5%水合氯醛(0.008 mL/g)麻醉，术后连续2 d腹腔注射4万单位青霉素。造模6周后，将去势小鼠随机分为5组，即模型组(Model)、依普拉芬组(IP98：每天80 mg/kg)、朝藿定A高、中、低剂量组(AH、AM、AL：每天20，10，5 mg/kg)。组间小鼠体质量无统计学差异(P>0.05)。去势后7周开始，给药组按体质量灌胃给药，连续8周；对照组及模型组给予相应体积的饮用水。

1.5.2血清样本检测 小鼠禁食8 h后，眼动脉取血并处死，将全血分别转移至离心管中，4℃静置30 min，3 000 r/min离心10 min，取上层血清保存于离心管中，按照ELISA试剂盒说明书的要求步骤对OPG和CTXⅠ进行检测。

1.5.3骨小梁微结构特性分析 剥离试验小鼠的单侧股骨和胫骨，胫骨采用10%甲醛溶液固定，采用Micro-CT沿标本的长轴方向对胫骨的内部结构进行扫描，获取连续不同层面的Micro-CT图像，重建后得到扫描区域的立体结构，采用配套软件分析骨小梁的微结构并收集骨小梁空间结构参数，如骨连接数(Conn.D)、骨模型指数(SMI)、骨表面积(BS)和各项异性指标(DA)。

1.5.4股骨HE染色 股骨于10%甲醛溶液中固定24 h后，转置于10%EDTA脱钙液中脱钙30 d，经ASP200S自动真空组织脱水机脱水浸蜡，Leica EG1150H自动生物组织包埋机包埋，Leica RM2255切片机制片，HE染色，Nikon Ci-L显微镜观察，HMIAS-2000高清晰度数码显微图像分析系统采图。

2 结果

2.1 朝藿定A对骨髓单个核细胞诱导分化形成破骨细胞的影响

2.1.1破骨细胞TRACP染色 按照ALP & TRACP染色试剂盒说明书步骤进行染色，破骨细胞分泌的TRACP被染成紫红色，浓度越高，颜色越深。由图1可见，由M-CSF和RANKL诱导的骨髓单个核细胞分化融合，形成大量破骨细胞并分泌大量TRACP，如MO组；给药后，E2和各浓度朝藿定A组的破骨细胞数量和TRACP分泌较MO组明显减少，其中朝藿定A对破骨细胞的抑制作用有一定的剂量依赖性。

CON.基础培养基；MO.破骨细胞诱导培养基；E2.含E2的破骨细胞诱导培养基;AL，AM，AH.朝藿定A低、中、高剂量的破骨细胞诱导培养基。下同

2.1.2破骨细胞骨吸收陷窝染色 骨吸收完成时，骨表面局部形成吸收陷窝。骨吸收陷窝呈圆形、椭圆形或不规则形(图2中箭头所示蓝色深染区域)，陷窝边界清晰，底面粗糙。从图2可以看出，破骨细胞在M-CSF和RANKL诱导下培养21 d，可使骨薄片上形成大面积骨陷窝，如MO组；E2和各浓度朝藿定A给药组的骨陷窝较MO组明显减少，其中朝藿定A对破骨细胞的抑制作用有一定的剂量依赖性。

图2 破骨细胞骨吸收陷窝染色

2.2 朝藿定A对小鼠血清中OPG和CTXⅠ含量的影响与对照组比较，小鼠模型组的OPG、CTXⅠ均显著升高(P<0.05)；而朝藿定A给药组OPG和CTXⅠ较模型组显著降低(P<0.05或P<0.01)，IP98组在这2个指标上无显著影响(图3)。

#示P<0.05；##示P<0.01；*示P<0.05,**示P<0.01。下同

2.3 朝藿定A对小鼠骨微结构的影响

2.3.1小鼠胫骨Micro-CT分析 与对照组比较，小鼠模型组BS、SMI、Conn.D均显著降低(P<0.01)，DA显著升高(P<0.01)；各给药组与模型组比较，阳性药IP98组各项指标均没有明显改善，AM组Coon.D和BS显著升高(P<0.01)；AH组Coon.D、SMI显著升高(P<0.05，0.01)，DA显著降低(P<0.01)，其他给药组DA也有下降趋势(图4)。

图4 小鼠胫骨骨微结构参数

2.3.2小鼠股骨HE染色 由图5可见，空白对照组胫骨上端骺板软骨细胞柱状排列不甚整齐，软骨各层细胞分界欠清楚，骨小梁(图中箭头所示粉色条状部分)及钙化区底部的过渡骨小梁形成较多，但不饱满，较细长或团块状，部分间隙较大；模型组胫骨上端骺板软骨细胞柱状排列不甚整齐，软骨各层细胞分界欠清楚，骨小梁及过渡骨小梁数目较空白对照组有所减少，但数目及形态结构与空白对照组比较差异不明显；阳性药组软骨细胞和骨小梁数目及形态结构与模型组比较有明显改善；朝藿定A组胫骨上端骺板软骨细胞柱状排列不甚整齐，软骨各层细胞分界欠清楚。骨小梁数目及形态结构与模型组比较均有所改善，以高剂量组改善较为明显。

CON.空白对照；MO.去势诱导骨质疏松模型；IP98，AL，AM，AH.IP98或朝藿定A低、中、高剂量试验组

3 讨论

骨质疏松发生于骨代谢的失衡，即骨吸收大于骨形成。骨骼是随着机械负荷不断重建的动态组织，而重建是旧的骨组织被取代的生理过程。骨重建发生在基本多细胞单元中，包括成骨细胞、破骨细胞和骨细胞[5]。

破骨细胞的主要作用是骨吸收，这些多核细胞来源于造血细胞系[6]，通过单核祖细胞的融合形成，例如单核细胞和骨髓巨噬细胞。M-CSF促进造血干细胞分化成单核巨噬细胞集落形成单位并保持其增殖和分化的能力。细胞开始表达TRACP直至形成成熟破骨细胞，只有成熟的破骨细胞才具有骨吸收能力。M-CSF和RANKL是破骨细胞分化和激活的2个重要诱导因子[7]。TRACP和骨吸收活性通常用于确定破骨细胞分化的阶段，成熟的破骨细胞含有大量的标志酶TRACP。当破骨细胞进行骨吸收时，TRACP从破骨细胞的溶酶体样结构分泌到骨吸收表面，并且使非胶原骨基质蛋白如骨桥蛋白和骨粘连蛋白去磷酸化，促进破骨细胞黏附到骨吸收表面。RANKL与其受体的结合导致单核祖细胞分化融合成多核破骨细胞。破骨细胞的活力在常态和大部分病理情况下与骨吸收的增加有关。OPG是一种诱导肽，由成骨细胞和成骨基质干细胞分泌，通过清除RANKL来减少与RANK的结合，从而抑制过多的骨吸收[8]。因此，无论正常或疾病状态下，骨髓中的RANKL/OPG率是骨质量的重要决定因素[9]。

从细胞试验结果可以发现，朝藿定A浓度在0.01～1.00 μmol/L时对诱导产生的破骨细胞TRACP酶有明显抑制作用，对成熟破骨细胞形成数目有一定的降低趋势。破骨细胞在M-CSF和RANKL诱导下培养14 d后，可以显著增加骨薄片上骨陷窝的形成，朝藿定A可以一定程度上抑制破骨细胞的分化和对骨薄片的破坏作用，骨陷窝的数目和面积都有不同程度的降低，说明朝藿定A浓度在0.01～1.00 μmol/L 时分别对原代破骨细胞的形成和TRACP分泌有抑制作用，并可以抑制原代破骨细胞对骨薄片的吸收作用，且呈剂量依赖性。王建钧等[10]建立成骨-破骨细胞共育体系，观察应用淫羊藿后碱性磷酸酶抗TRACP的变化，结果显示淫羊藿可显著降低 TRACP 的活性，提示淫羊藿可增强共育体系中成骨细胞活性、抑制破骨细胞的功能，与本研究结果类似。

血液中CTXⅠ的含量主要反映破骨细胞骨吸收的速率和骨转换情况，升高则提示骨吸收速率加快[11]。IP98是一种临床上已经用于治疗骨折疏松的西药[12]，属于非激素类异黄酮类衍生物化合物，与朝藿定A类别相近，属于植物雌激素，具有雌激素样作用，但不具有雌激素固有的特性和副作用。IP98有抑制骨吸收又有刺激骨形成的作用。动物试验中，IP98对去睾丸诱导骨质疏松小鼠没有明显的治疗作用，比较之下，朝藿定A给药组OPG、CTXⅠ显著降低，证实朝藿定A可以通过降低血液中CTXⅠ和OPG水平，从而减少骨吸收，改善骨质疏松状态。

骨质疏松模型的建立成功与否常常需要多个方面决定，即骨量、力学特性、骨微结构、生化代谢指标的变化。骨组织病理图片和CT扫描数据在抗骨质疏松效果评估中显示着巨大优势。经过Micro-CT扫描发现，给药后骨微结构各项参数均有所改善；病理组织学观察骨微结构结果显示，朝藿定A高剂量组骨小梁数目及形态结构与模型组比较有明显改善。

综上所述，朝藿定A可以抑制原代破骨细胞的形成和TRACP的分泌，同时抑制原代破骨细胞对骨薄片的吸收功能；通过改善骨质疏松模型小鼠的骨微结构和血清骨转换标志物含量，达到改善骨质疏松的作用，且有一定的剂量依赖性。