孔卫青，凌 君，杨金宏

(安康学院 陕西省蚕桑重点实验室, 陕西安康 725000)

桑花叶卷叶病相关病毒(Mulberry Mosaic Leaf Roll-associated Virus，MMLRaV)寄生桑树引起的桑花叶卷叶病，又称桑花叶型萎缩病，是桑树的重大病害之一。患病桑树叶脉有瘤状突起，严重枝条停止伸长，叶片皱缩变小，叶缘卷曲，硬化早[1]。该病可以通过线虫、嫁接等多种方式传播[2]，在中国蚕桑产区发生普遍，浙江、江苏、陕西、四川、重庆等国内主要蚕桑产区发病率从4.6%到76.9%，造成桑树严重减产，每年春、秋二季损失桑叶约30000t，折合损失蚕茧约2300t。

MMLRaV属于线虫传多面体病毒属(Nepovirus)，该属病毒平均直径为27.84nm[3]，也有报道为28～30nm[4]，在植物体内以双联体病毒粒子存在，部分病毒伴生有卫星RNA[5-7]。MMLRaV基因组由2条单链正义RNA组成，RNA1链有6309个编码碱基，编码2102个氨基酸，携带病毒复制及RNA稳定的关键基因。RNA2链有3279个编码碱基，编码1092个氨基酸，N末端和C末端分别为运动蛋白基因(movement protein，MP)和外壳蛋白(coat protein，CP)基因[4]。其中MP基因控制病毒克服细胞壁的屏障，并从最初感染的细胞向其它部位扩散，即实现细胞间移动(短距离运输)和通过维管束系统的长距离移动[8]。

CP基因编码的病毒外壳蛋白是病毒唯一的结构蛋白，作为一种非细胞生命体，病毒的遗传物质仅仅简单的被CP蛋白包裹，因此，CP基因影响着病毒粒体的形成和稳定性，其蛋白质外壳上的化学基团——抗原决定簇也决定了抗原特异性，影响其线虫传播特性和血清学特性，在病毒的侵染过程中扮演多种角色[8-9]。卢全有等[10]曾利用MMLRaV RNA2链C端CP基因的序列片段进行融合蛋白表达，并制备了多抗血清，但其没有进行进一步应用。目前国内也没有针对该病毒的纯化试剂盒。为此本试验对安康学院基地桑树苗圃中的MMLRaV的RNA2链CP基因核心结构区的序列多样性进行分析，并制备了优势基因型的多克隆抗体，偶联Tosylactivated磁珠，建立了磁珠免疫qPCR方法，可用于MMLRaV的纯化和检测。

1 材料与方法

1.1 病毒来源

MMLRaV分离自陕西省蚕桑重点实验室恒口基地桑树苗圃，经检测病株中同时存在有356 nt的环状小RNA病原桑花叶萎缩类病毒(Mulberry Mosaic Dwarf viroid，MMDVd)。

1.2 主要试剂

1.3 方 法

1.3.1 病毒CP基因的克隆 从感染MMLRaV桑花叶卷叶病植株中随机选5株，取叶片进行液氮速冻和研磨，后按试剂盒说明书使用北京天根植物RNA提取试剂盒提取总RNA，使用反转录试剂盒的随机引物对总RNA进行反转录，并以此为模板，引物对A-CPF和A-CPR进行PCR扩增和TA克隆。每个样本随机选取10个阳性克隆进行测序。

1.3.2 序列多样性分析及表达载体的构建 MEGA X软件分析序列的多样性[13]，根据优势序列设计引物SA-CPF和SA-CPR，利用同源重组方法将序列克隆至表达载体pET-28a-SUMO，重组质粒进行测序鉴定并转化至菌株E.coliRosetta。

1.3.3 融合蛋白的诱导表达及可溶性分析 挑取阳性单克隆菌株至含50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基，37 ℃振荡培养至OD600为0.5～ 0.6，加入0.8 mmol IPTG，继续诱导培养4 h。诱导后的培养液在 12 000 r/min离心5 min，所得沉淀加入50 mmol的PBS缓冲液重悬，并进行冰浴超声裂解破碎。裂解破碎后的菌体于4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，上清与沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，分析检测诱导表达融合蛋白的可溶性。

1.3.4 包涵体的亲和层析纯化 配制含20 mmoL Tris(pH 8.0)，300 mmoL NaCl，8 M Urea，20 mmoL Imidazole的溶解缓冲液溶解包涵体，同时平衡镍离子柱(Ni-IDA树脂)，使用亲和层析纯化纯白，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，收集各洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测，使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。

1.3.5 抗体制备与检测 检测合格的蛋白质进行抗体制备与纯化。分别于1、12、26、40、54 d注射日本大耳白兔，初次0.3 mg免疫剂量，利用完全弗氏佐剂，后续每次0.15 mg蛋白质，利用不完全弗氏佐剂，66 d采血，利用抗原亲和法纯化抗体。将抗体稀释1 000倍，与10、5、1、0.5 ng原核表达的蛋白质抗原进行Western blot反应，分析抗体对不同浓度抗原的检测能力。将诱导表达的CP蛋白抗原(500 ng/mL)包被酶联板，ID-ELISA法测定所得抗体效价。

1.3.7 定量分析 利用Random6引物对病毒提取液和纯化的病毒2个样本进行反转录，后以MMLRaV的RNA2为内参基因，定量PCR(Quantitative PCR，qPCR)方法检测病毒提取液和纯化病毒中背景桑树基因组及伴生MMDVd含量的变化。利用2-ΔΔCt方法通过RNA2的预扩增Ct值调整样本cDNA浓度[14]，使2个样本间的Ct值差小于1，以此为模板，检测2样本中桑树Actin基因、TUB2基因和MMDVd的含量。

2 结果与分析

2.1 CP基因序列克隆及多样性分析

利用bepipred 2.0软件[11]基于序列的random forest模型预测MMLRaV CP蛋白表位抗原，结果显示位于127-328区段的氨基酸，分值大于0.5的位点较多，抗原性较好，可以用于诱导抗体(图1)。对该区段进行PCR扩增和克隆测序，去除引物位点后获得692个核苷酸位点。MEGA X分析序列多样性，结果50条序列有19个克隆株，其中CP16含序列数最多10条，是优势序列(图2)。进一步分析序列有75个多态性位点，其中7个位点的突变造成了6个氨基酸的变化，可翻译为5条相似的氨基酸序列，分析显示各氨基酸的变化对CP蛋白抗原性的影响不显著，因此以优势序列CP16为模板制备抗体。

2.2 重组表达载体的构建与融合蛋白的诱导表达

同源重组方法将CP基因克隆至原核表达载体pET-28a-SUMO，其中含有6×His标签，用于表达的融合蛋白的纯化。经测序鉴定正确的重组质粒pET-28a-SUMO-H16转化大肠杆菌E.coliRosetta进行CP蛋白诱导表达。分别对未诱导表达、诱导表达、裂解上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳检测，结果显示全菌和沉淀组分均在38kda附近出现特异性目标蛋白，目标蛋白主要以包涵体形式存在(图3)。

2.3 蛋白纯化与抗体的制备

使用亲和层析(Ni-IDA 树脂)镍离子柱对表达的包涵体蛋白进行纯化，SDS-PAGE检测洗脱组分中蛋白的纯度和含量(图3)，测定洗脱组分的蛋白质量浓度为4 mg/mL，纯度和浓度达到免疫要求，注射免疫日本大耳左兔制备抗体，所得抗体质量浓度为2.77 mg/mL。Western杂交显示抗体稀释1 000倍可以检测到500 pg抗原(图4)，所得抗体质量浓度为2.77 mg/mL。ID-ELISA测定抗体效价，结果血清稀释512 000倍，其P/N值(OD405抗血清/OD405阴性血清)仍大于2.0(稀释1∶64 000后的OD405阴性血清均按0.060)，表明抗体效价在1/512 000以上(图5)。

2.4 抗体对桑花叶卷叶病相关病毒纯化效果 检测

利用偶联Tosylactivated磁珠的抗体与病毒提取液进行孵育，通过抗体抗原之间的非共价的特异性结合纯化样本中的病毒。以MMLRaV RNA2为内参进行qPCR分析(通过认为调整至相同浓度)，结果显示MMDVd在病毒提取液和纯化后的病毒样本中的含量较为接近，而桑树基因TUB2和actin在纯化前后的病毒提取液中的差异较大，分别达631和127倍(图6)，说明该纯化方法极大的减少宿主的RNA，病毒纯化效果较好。

3 讨 论

与DNA的复制相比，RNA病毒的复制没有错配修复程序，因此其基因组的多样性较高。针对此类基因组突变高的微生物，Tettelin等[15]2005年提出了微生物泛基因组(pan-genome)概念，即某一物种全部基因的总称。本研究分析的MMLRaV的CP基因的692 bp的序列中，5个随机样本的50条克隆序列中有19个克隆株，75个多态性位点，6个氨基酸的变化，多样性远高于植物DNA病毒[16]。本研究选择了CP16优势序列为模板制备抗体，能够最大程度的降低抗体的 脱靶。

木本植物病毒的含量较低，难以纯化，植物检疫特异性差，错误率较高。蛋白质的磁珠分离是以磁珠为介质的蛋白质分离技术，通过在磁珠表面修饰离子交换基团或亲和配基等，与目标蛋白质产生特异性吸附作用分离蛋白质[17]。B细胞分为线性和构象性2种，包涵体可以诱导线性B细胞抗体[18]。本研究利用原核表达技术可以大量获得MMLRaV外壳蛋白的包涵体的表达，避免了直接纯化病毒制备抗血清寄主蛋白、以及病毒量低、稳定性差等问题的影响。制备的抗体可用于MMLRaV的血清学检测[10]，抗体交联免疫磁珠用于MMLRaV病毒的纯化可以显著减少宿主RNA，获得纯度较高的病毒样本。

类病毒和卫星RNA都是大小为246～401 bp的环状单链RNA分子，二者的有相似的结构和复制机制，区别在于类病毒有致病作用，不依赖植物体内宿主病毒的存在，而卫星RNA是线虫传多面体病毒属的伴生RNA[5-7]。MMDVd是在桑树中发现的环状单链RNA病原，对于其准确的生物学地位迄今尚未定论[19-20]。MMLRaV属于线虫传多面体病毒属(Nepovirus)，本试验利用MMLRaV RNA2作内参，发现两个宿主的看家基因纯化前后的变化较大，而MMDVd的变化较小，说明其与MMLRaV可能存在某种伴生关系。