何肖君，李 珑，梁胜祥，柳维林*

（1.福建中医药大学康复医学院，福建 福州350122；2.福建中医药大学康复产业研究院，福建 福州350122）

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种与年龄相关的进行性神经退行性疾病，65岁以上人群有10%患有AD［1］。AD临床症状表现为记忆障碍、失语、失用、失认和执行功能障碍等认知功能障碍［2］。普遍认为AD主要病理改变是淀粉样蛋白β（Aβ）沉积形成老年斑和细胞内神经原纤维tau缠结的累积［3］。针刺疗法是中医学重要组成部分，大量研究表明针刺“百会”“神庭”治疗痴呆具有很好效果［4］。目前，功能磁共振成像（fMRI）已被广泛用于揭示电针疗效影响的相关脑区，局部一致性（regional homogeneity，ReHo）作为静息态功能磁共振成像（rsfMRI）的一种分析方法，反映静息状态下脑自发性神经元活动，是研究静息状态下局部脑区活动变化的重要指标之一［5］。因此，本文利用血氧水平依赖（blood oxygen level dependent，BOLD）信号脑区局部一致性探讨电针“百会”“神庭”穴对AD模型小鼠空间识别功能的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物2月龄雄性5×FAD小鼠和雌性野生小鼠，购自虔碧生物科技有限公司，饲养于福建中医药大学实验动物中心，许可证号：2020-0002，模拟标准日夜系统，自由摄食饮水。实验过程所有动物的处理均严格按照实验动物使用指南（National Academy Press）进行（伦理编号：FJTCMIACUC 2019031）。

1.2 实验试剂Biospin DNA提取试剂盒（杭州博日科技股份有限公司）；DNA鉴定引物（上海生工生物有限公司）；异氟烷（深圳瑞沃德生命科技有限公司）。

1.3 实验仪器 小动物磁共振扫描仪（德国Bruker公司）；小鼠旷场反应箱（上海欣软科技信息有限公司）；电针仪（上海华谊牌公司）；PCR扩增仪（美国Thermo Fisher Scientific公 司）；0.5寸 不 锈 钢 毫 针（苏州医疗用品厂有限公司）。

2 方 法

2.1 转基因小鼠鉴定与分组 将雄性5×FAD小鼠和雌性野生小鼠杂交后得到子代，幼鼠出生后21 d对其剪耳标进行标记，然后取鼠尾0.5 cm进行基因提取，DNA提取按照试剂说明书操作。将提取的DNA组织与PCR Master Mix、RNA-free水以及待测基因引物按比例配制混匀后置于PCR扩增仪中扩增。在琼脂糖凝胶上上样并进行电泳（电压100 V，时间60 min），最后进行显影成像。目标基因APP和PS1的分子量分别为377 bp和608 bp，成像的条带同时表达APP和PS1两条条带的待测小鼠为5×FAD阳性小鼠。将阳性小鼠分为雌雄不同性别后再按照随机数字表法分为模型组和电针组，此外取同等数量的同窝阴性小鼠作为野生对照组。

2.2 干预 电针组：取小鼠“百会”穴（前正中线，两耳尖连线中点）和“神庭”穴（前正中线，额顶骨缝交界线前方），两穴均采用45°斜刺2 mm，电针仪参数设置为：频率2／20 Hz，疏密波，电压峰2 V，每次30 min，每日1次，每周5次，总共干预4周。野生组和模型组只进行每日从饲养笼中抓取，不给予其它治疗。

2.3观察指标及方法

2.3.1 旷场实验 旷场实验用来检测小鼠的运动功能与探索能力。在测试前1 d将实验动物置于反应箱（40×40×50）cm3适应10 min，允许其自由探索。正式测试时，将小鼠置于反应箱正中心位置，并令其在箱子自由探索10 min，箱子顶部摄像机记录其运动轨迹，每只动物测试完后用75%酒精进行清洁。最后对小鼠活动总路程、中央区域停留时间和平均运动速度等指标进行分析。

2.3.2 新位置识别实验 新位置识别实验检测小鼠空间识别能力。适应期：训练前1 d将实验动物放置于反应箱（40×40×50）cm3适应10 min，允许其自由活动；训练期：在反应箱的西北角和西南角放置物体A和物体B，将实验动物放在反应箱中央使其头部与两物体的距离相同，在5 min内记录小鼠与两物体接触情况，并观察距离物体2～3 cm的探索物体时间；测试期：将西南角的B物体移至东南角记为物体C，其他物体位置保持不变，将实验动物放在反应箱中央使其头部与两物体的距离相同，在反应箱中自由活动10 min，记录小鼠对物体A和物体C的探索时间，记为TA和TC。

2.3.3 静息态脑功能观察 将小鼠置于3%的异氟烷中诱导麻醉，然后以1.5%异氟烷维持，将小鼠头部置于小鼠表面线圈内，实时监测大鼠的呼吸和心率，同时打开水温箱保持水温维持恒定。T2WI参数：回波时间（TE）／重复时间（TR）＝4 200 ms／35 ms，视野大小（FOV）＝20 mm×20 mm，层数（Slices）＝35，层厚（Slices Thickness）＝0.5 mm，矩阵（matrix）＝256×256。随后采用BOLD-fMRI扫描，参数为TE＝10 279 ms，TR＝2 000 ms，FOV＝20 mm×20 mm，Averages＝4，Image size＝64×64，Slices Thickness＝0.5 mm。ReHo分析采用统计参数图工具包（SPM）和静息态功能磁共振数据处理助手（DPARSF）软件包进行分析。

2.3.4 统计学方法 应用SPSS 25.0软件进行统计分析，计量资料符合正态分布采用（±s）表示，方差呈齐性，两两比较采用LSD分析，方差不齐，两两比较采用Dunnett's检验。行为学统计分析以P＜0.05为差异具有统计学意义，ReHo图像统计分析以P＜0.005，簇（Cluster）＞10个体素认为差异具有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组小鼠探索能力与自发活动水平观察 干预前和干预后旷场实验各组小鼠在总路程、平均速度和中央区域停留时间等指标比较差异无统计学意义，表明电针“百会”“神庭”对5×FAD小鼠探索能力和自发活动水平无影响，见表1。

表1 干预前后3组小鼠旷场实验结果比较（±s）

表1 干预前后3组小鼠旷场实验结果比较（±s）

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3.2 空间识别记忆检测 在干预前，模型组和电针组较野生组新位置识别辨别指数下降（P＜0.01），在干预后电针组较模型组新位置识别辨别指数上升（P＜0.01），因此，电针“百会”“神庭”对5×FAD小鼠空间识别记忆有改善作用，见表2。

表2 3组小鼠新位置识别辨别指数比较（±s）%

表2 3组小鼠新位置识别辨别指数比较（±s）%

注：与野生组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01。

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3.3 各组小鼠脑区BOLD信号分析 干预后野生组、模型组和电针组各组小鼠用一时间序列不同脑区的BOLD信号局部一致性比较，为了便于观察，将有统计学意义的结果叠加在一个Paxinos和Franklin空间的T2WI小鼠脑模板上，彩色区域表示2组组间比较的差异具有统计学意义的脑区（P＜0.005，Clusters＞10）（图1）。与野生组相比，模型组BOLD信号局部一致性降低的脑区包括双侧海马脑区、右侧尾状核；与模型组相比，电针组BOLD信号局部一致性升高的脑区包括右侧海马脑区、右侧尾状核和左侧感觉皮层，见表3。

表3 干预后各组小鼠局部一致性比较

图1 干预后各组小鼠局部一致性比较结果图

4 讨 论

在我国古代文献中，AD属于“呆病”“神志疾病”和“郁证”等。李时珍云：“脑为元神之府”，即痴呆病位在脑，其病机多为髓海不足、神机失用。督为阳脉之海，六阳经气均汇集于此，“百会”属督脉，顶骨正中，称“三阳五会”，故能通达阴阳脉络，调节人体内部阴阳之气；“神庭”是督脉、阳明经和足太阳交汇之穴，《淮南子》曰：“是故神者，智之渊也，渊清则智明矣”。“神庭”穴具有开窍、宁神作用。临床实践已证明针刺疗法是防治认知功能障碍的有效方法，一项系统评价纳入1 421名脑卒中后认知功能障碍患者，针刺“百会”“神庭”4周后认知功能改善［6］。并且有临床实验研究比较针刺与药物治疗AD的临床疗效差异，发现针刺组与药物治疗组均改善认知功能，且针刺“百会”“神庭”等穴疗效优于药物治疗组［7］。同时，动物研究也表明针刺可改善AD模型动物空间学习与记忆障碍［8］。本研究也发现电针“百会”“神庭”可提高AD小鼠的新位置识别辨别指数，改善早期空间识别功能。

以往研究表明，AD疾病中神经原纤维tau蛋白病理改变首先出现在内嗅皮层，其次是海马的CA1区，最后延伸到CA4区，并且这些区域的神经原纤维病理改变最终会引发神经元功能障碍和死亡，从而导致记忆功能受损，因此这是早期认知功能障碍的诊断标记物［9］。海马损伤在AD病理过程中具有区域特异性，一项研究纳入大约200名认知正常的老年人、400名轻度认知功能障碍（mild cognitive impairment，MCI）患者和200名早期AD患者进行随访2～3年，基于MRI的海马局部成分分析（LoCA）显示海马体积与脑脊液中β淀粉样蛋白和tau蛋白以及认知功能测量值之间的关联非常显著［10］。海马作为学习与记忆核心脑区，海马体的损伤通常会产生时间分级的逆行性遗忘症，即最近获得的记忆比远期获得的记忆受损更严重，并表现出相应空间学习记忆障碍［11］。对AD模型APP／PS1转基因小鼠电针“百会”穴治疗4周，通过减少海马和皮层Aβ沉积、提高BDNF表达和促进神经发生来改善学习记忆功能［12］。对血管性认知障碍大鼠针刺“百会”“足三里”2周可以通过上调海马脑区谷氨酸受体的表达以及增加神经元的存活来改善空间记忆功能［13］。

以往研究对MCI和AD患者的脑容积分析主要集中于皮质、海马、颞叶等认知功能相关的脑区，而尾状核等与认知功能无直接联系的脑区则鲜有报道。近年来对路易体痴呆和帕金森病痴呆患者的神经影像学研究显示，患者尾状核出现明显萎缩［14］。有研究显示，与同年龄段正常人比较，AD患者和MCI患者的尾状核等脑深部核团的磁共振成像体积明显 缩 小［15］，并 且 可 能 与 患 者 认 知 功 能 下 降 有 关［16］。有研究基于rs-fMRI分析AD患者海马与全脑功能连接的动态变化情况，发现AD患者左侧海马与右侧尾状核的功能连接具有增强的时间变异性［17］。记忆和认知过程需要脑网络的整合，海马记忆环路（Papez环路）是参与情景记忆编码、形成和巩固的重要节点。有研究以海马为种子，rs－fMRI发现丘脑、尾状核、扣带回皮层区域参与了Papez环路，并且在涉及学习和记忆功能的大脑区域功能连接明显下降，与情景记忆表现有显著相关性［18］。

rs-BLOD-fMRI是基于检测氧与血红蛋白结合来反应神经元活动状态，目前基于rs-BLOD-fMRI对AD研究众多［19］。ReHo是用于分析脑局部活动，以往研究发现患MCI与AD人群较正常老年人楔形皮质、双侧后扣带回和内侧前额叶的ReHo均降低，并且情景记忆功能与ReHo呈正相关，因此ReHo可以作为AD认知功能障碍的预测指标［20］。本研究ReHo分析发现，AD小鼠早期双侧海马和右侧尾状核BOLD信号局部一致性下降，而电针“百会”“神庭”提高AD小鼠的右侧海马和尾状核BOLD信号局部一致性。

本研究结果显示，AD早期出现空间识别功能障碍，电针“百会”“神庭”可能通过提高海马和尾状核BOLD信号局部一致性活动，从而改善空间识别功能。未来研究应更进一步观察海马-尾状核功能连接变化，为理解AD病理机制提供更可靠的实验依据。