秦存梅

摘  要：目的  探討Xpert MTB/RIF检测法在支气管肺泡灌洗液结核分枝杆菌检测中的应用价值。方法  选取2018年5月～2019年5月山东省枣庄市肿瘤医院收治的150例疑似肺结核患者为研究对象，以支气管肺泡灌洗液作为病原学检测标本，分别以病原学诊断活动性结核病和临床诊断活动性结核病为金标准，以Xpert MTB/RIF为待测标准，分析Xpert MTB/RIF对病原学和临床诊断结核的诊断价值。结果  在150例灌洗液标本中确诊肺结核130例，离心涂片抗酸染色法抗酸杆菌阳性45例，阳性率为34.62%;Xpert MTB/RIF检测法抗酸杆菌阳性57例，阳性率为43.85%;Xpert MTB/RIF检测法抗酸杆菌阳性率明显高于离心涂片抗酸染色法，差异有统计学意义（P<0.05）。130例肺结核患者中，病原学诊断结核57例（43.95%），临床诊断结核67例（51.54%）;肺结核合并支气管结核102例（78.46%），单纯肺结核107例（82.31%）。Xpert MTB/RIF在病原学诊断和临床诊断结核的敏感度分别为77%（95%CI：63%～88%）和52%（95%CI：41%～63%）（P<0.05）;肺结核合并支气管结核的敏感度为81%（95%CI：67%～89%），单纯肺结核的敏感度46%（95%CI：35%～59%）;病原学诊断和临床诊断结核、合并支气管结核和单纯肺结核特异度均为100%（95%CI：98%～100%）。Xpert MTB/RIF检测病原学诊断结核敏感度高于临床诊断结核，肺结核合并支气管结核敏感度高于单纯肺结核（P<0.05）;支气管肺泡灌洗液的MTB核酸检出载量病原学诊断结核高于临床诊断结核（P<0.05）。结论  支气管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF检测在肺结核诊断中具有较高的价值和敏感性，有助于提高肺结核病因的检出率。

关键词：支气管肺泡灌洗液;Xpert MTB/RIF检测;肺结核;诊断价值

中图分类号：R373.9    文献标识码：A    文章编号：1009-8011（2021）-3-0014-04

Abstract： Objective  To explore the application value of Xpert MTB/RIF detection method in the detection of Mycobacterium tuberculosis in bronchoalveolar lavage fluid. Methods 150 cases of suspected pulmonary tuberculosis patients admitted to Zaozhuang Cancer Hospital in Shandong Province from May 2018 to May 2019 were selected as the research objects. Bronchoalveolar lavage fluid was used as the pathogenic test specimens to diagnose active tuberculosis and clinical diagnosis respectively. Active tuberculosis is the gold standard， and Xpert MTB/RIF is used as the test standard to analyze the diagnostic value of Xpert MTB/RIF in the etiological and clinical diagnosis of tuberculosis. Results Among 150 lavage fluid specimens， 130 cases of tuberculosis were diagnosed， 45 cases were positive for acid-fast bacilli by centrifugal smear acid-fast staining， the positive rate was 34.62%; 57 cases were positive for acid-fast bacilli by Xpert MTB/RIF detection， and the positive rate was 43.85 %; The positive rate of Xpert MTB/RIF detection method of acid-fast bacilli was significantly higher than that of centrifugal smear acid-fast staining method， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Among the 130 cases of pulmonary tuberculosis， 57 cases（43.95%） were diagnosed pathogenically， 67 cases（51.54%） were diagnosed clinically; 102 cases（78.46%） of pulmonary tuberculosis complicated with bronchial tuberculosis， and 107 cases（82.31%） of simple pulmonary tuberculosis. The sensitivity of Xpert MTB/RIF in the pathogenic diagnosis and clinical diagnosis of tuberculosis was 77%（95%CI： 63%～88%） Sum 52%（95%CI： 41%～63%）（P<0.05）; the sensitivity of pulmonary tuberculosis combined with bronchial tuberculosis was 81%（95%CI：67%～89%），the sensitivity of simple tuberculosis is 46%（95%CI：35%～59%）; the specificity of pathogenic diagnosis and clinical diagnosis of tuberculosis， combined bronchial tuberculosis and simple pulmonary tuberculosis are all 100% （95%CI： 98%～100%）. Xpert MTB/RIF detection is more sensitive to the pathogenic diagnosis of tuberculosis than the clinical diagnosis of tuberculosis， and the sensitivity of pulmonary tuberculosis combined with bronchial tuberculosis is higher than that of simple pulmonary tuberculosis（P<0.05）; the detection load of MTB nucleic acid in bronchoalveolar lavage fluid is higher In the clinical diagnosis of tuberculosis（P<0.05）. Conclusion Xpert MTB/RIF detection of bronchoalveolar lavage fluid has high value and sensitivity in the diagnosis of pulmonary tuberculosis， which helps to improve the detection rate of the cause of pulmonary tuberculosis.

Keywords： bronchoalveolar lavage fluid; Xpert MTB/RIF detection; pulmonary tuberculosis; diagnostic value

结核病由于细菌数量少等原因，往往难以获得阳性结果，临床上常对结核病进行诊断。研究资料显示[1]，结核病病原学诊断准确率不到40%，对于疑似结核患者涂片阳性率更低。在我国近期颁布的结核病诊断行业标准中，分子生物学方法也被作为病原学诊断的依据之一。因此，寻找新的分子生物学方法并评价其在我国结核病诊断中的应用价值，对于提高临床诊断结核病检测的敏感性具有重要意义。Xpert MTB/RIF方法是一种基于全自动实时半巢式核酸扩增为主的技术，主要用于结核病的快速检测和利福平耐药性的同时检测[2]。基于此，本文选取2018年5月～2019年5月我院收治的150例疑似肺结核患者作为研究对象，旨在探讨Xpert MTB/RIF检测法在支气管肺泡灌洗液结核分枝杆菌检测中的诊断价值，现报如下。

1  资料与方法

1.1  一般资料

选取2018年5月～2019年5月山东省枣庄市肿瘤医院收治的150例疑似肺结核患者作为研究对象，有疑似活动性结核病的临床症状和体征，行纤维支气管镜检查并留取支气管肺泡灌洗液。其中男78例，女72例。入选的年龄在18～65岁之间，其中18～50岁31例，20～60岁50例，20～65岁69例。所有患者既往均无肺结核治疗史。本研究经过我院伦理委员会批准，患者家属均自愿签署知情同意书。

1.2  选取标准

1.2.1  纳入标准

（1）符合病原学诊断结核标准[3]：有疑似活动性结核病的临床症状和体征，涂片抗酸杆菌检测阳性和/或分枝杆菌培养阳性且经菌种鉴定为MTB复合群。（2）临床诊断结核标准。有疑似活动性结核病的临床症状和体征，临床表现为咳嗽、咳痰2周，或咯血者，同时有典型的肺结核影像学改变者，免疫学检查（结核菌素皮肤试验或γ干扰素释放试验）阳性，PPD硬结平均直径15mm或局部出现水泡、坏死及淋巴管炎者，抗结核治疗有效，经鉴别诊断排除其他肺部疾病。（3）符合本文病原学诊断和临床诊断结核标准：存在支气管镜下典型的气管、支气管内膜结核病变和典型的组织病理学改变;胸部影像学检查符合气管、支气管结核影像学改变。（4）符合非结核呼吸道感染性疾病诊断标准。同时满足以下条件：①存在确切的其他病原感染证据（如其他细菌、病毒、支原体感染等）;②常规抗炎治疗后病情好转或治愈;③存在呼吸系统感染癥状，且除外结核病诊断;④诊断为其他呼吸系统感染性疾病。（5）具有支气管镜检查的适应证。

1.2.2  排除标准

（1）排除合并白血病、先心病等重大疾病及长期糖皮质激素等免疫抑制剂治疗者。（2）排除支气管肺泡灌洗液标本量不足以同时完成本研究多种方式的病原学检测，或虽行支气管肺泡灌洗液标本采集但住院时间少于2d的患者。

1.3  研究方法

以支气管肺泡灌洗液作为病原学检测标本，以病原学诊断为金标准，以临床诊断活动性结核病和抗酸染色为相对金标准，以Xpert MTB/RIF为待测标准，考察支气管肺泡灌洗液的Xpert MTB/RIF对结核病的诊断价值。

1.3.1  灌洗液采集

局麻后，患者取仰卧位，纤维支气管镜经鼻腔进入，检查各部分病变情况后，在病灶部位注入适量生理盐水，收集灌洗液。将灌洗液分为3份，分别用于离心涂片抗酸染色法和Xpert MTB/RIF检测。

1.3.2  离心涂片抗酸染色法

依据《中国结核病防治规划实施工作指南（2008年版）》进行[4]。取2mL灌洗液加入一次性试管中，在4℃下以3000r/min离心15min，弃掉上清液，混匀试管底部沉渣进行涂片，涂布面积1cm×2cm，均匀抹成10mm×20mm的卵圆形液膜，固定后滴加石炭酸复红染液，染色10～15min，3%盐酸酒精脱色1min，美蓝复染0.5～1.0min，流水冲洗后待干镜检。

1.3.3  Xpert MTB/RIF检测

取2mL灌洗液标本与含氢氧化钠及异丙醇的处理液混合，在涡旋震荡器上震荡15～30s，室温静置15min。取混合液2mL转移至一次性多室塑料反应盒中，然后将反应盒放置到检测模块，采用Xpert MTB/RIF检测仪（美国Cepheid公司）进行自动化分析，使用试剂盒内提供的专用无菌移液管，取2mL处理后样本由检测匣的加样孔缓慢加入，关闭检测匣的盖子，置于检测模块，仪器开始自动检测。Xpert MTB/RIF检测到MTB目标DNA后，基于样本中MTB的Ct值，间接反映所检测样本中MTB的载量，以高、中、低、极低来显示。

1.4  统计学分析

采用SPSS23.0软件进行数据分析。计数资料采用率或构成比进行描述，分别以病原学诊断和临床诊断为金标准，根据四格表计算Xpert MTB/RIF检测方法的诊断性参数指标，组间比较采用卡方检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  离心涂片抗酸染色法与Xpert MTB/RIF检测法检测结果比较

在150例灌洗液标本中确诊肺结核130例，离心涂片抗酸染色法抗酸杆菌阳性45例，阳性率为34.62%;Xpert MTB/RIF检测法抗酸杆菌阳性57例，阳性率为43.85%;Xpert MTB/RIF检测法抗酸杆菌阳性率明显高于离心涂片抗酸染色法，差异有统计学意义（χ2=7.282，P<0.05）。见表1。

2.2  Xpert MTB/RIF在肺结核的诊断参数

病原学诊断+临床诊断结核敏感度60%（95%CI：50%～70%），特异度100%（95%CI：97%～100%），阴性预测值81%（95%CI：78%～88%）;敏感度病原学诊断结核高于临床诊断结核（77% vs 52%），差异有统计学意义（χ2=7.184，P=0.002），特异度均为100%，阴性预测值均>85%;肺结核合并支气管结核敏感度高于单纯肺结核（81% vs 46%），差异有统计学意义（χ2=8.631，P<0.001），特异度均为100%，阴性预测值均>85%。

病原学诊断结核中，Xpert MTB/RIF检测阳性34例，其中极低MTB载量14例（41.2%）、低载量11例（32.4%）、中等载量7例（20.6%）、高载量2例（5.9%）。临床诊断结核中，Xpert MTB/RIF检测阳性57例，其中极低MTB载量20例（47.6%）、低载量20例（47.6%）、中等载量2例（4.8%）。根据Xpert MTB/RIF检测的半定量结果等级进行比较，支气管肺泡灌洗液的MTB核酸检出载量病原学诊断结核高于临床诊断结核，差异有统计学意义（χ2=7.657，P=0.025）。

3  讨论

根据世界卫生组织（WHO）2015年报告，世界上每年每100万肺结核患者中就有14万死于该病。我国结核病患者数量居世界第三位，是结核病的高负担国家之一。目前结核病疫情不容乐观，给社会带来巨大安全隐患。由于患者个体的特殊性，结核病感染时缺乏典型症状，疾病往往隐蔽性强，临床表现复杂，加上抽痰困难，肺结核易误诊为呼吸道感染，因此早期实验室诊断结核病尤为重要。传统的结核分枝杆菌（MTB）培养时间长，不能满足临床早期、快速诊断的需要，患者不能得到及时的诊断和治疗，延误治疗[5]。抗酸染色涂片法不能区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。同时，由于患者结核带菌量低、标本采集困难等特点，很难获得患者结核病病原学诊断的临床证据。因此，需要建立一种新的、更准确的诊断方法以有效地提高结核病的诊断效率。

Xpert MTB/RIF检测法是以半巢式实时定量PCR技术为基础，以利福平耐药相关rpob基因为靶基因，自动提取DNA后扩增rpob基因的192bp片段进行检测，2h同时检测结核分枝杆菌和利福平耐药情况，它的应用提高巢式PCR的灵敏度2～3个数量级，减少非特异性扩增。世界卫生组织2014年发布的《结核病管理指南》建议将其用于结核病的诊断，建议将其作为结核病疑似患者脑脊液抗酸染色或细菌培养前的初步筛查，耐多药结核病和结核性脑膜炎。对于怀疑为肺外结核的非呼吸道标本，在条件允许的情况下，可作为传统抗酸染色、细菌培养或组织病理学的替代方法。世界卫生组织还指出，由于患者方面的数据较少，一些建议的证据水平较低[6]。因此，开展Xpert MTB/RIF方法在患者不同体液和组织标本中的临床价值研究，对于推动结核病的早期诊断具有非常重要的临床意义。本研究在150例灌洗液标本中确诊肺结核130例，离心涂片抗酸染色法抗酸杆菌阳性45例，阳性率为34.62%;Xpert MTB/RIF检测法抗酸杆菌阳性57例，阳性率为43.85%;Xpert MTB/RIF检测法抗酸杆菌阳性率明显高于离心涂片抗酸染色法，差异有统计学意义（χ2=7.282，P<0.05）。目前，Xpert MTB/RIF测试仪器价格昂贵。然而，该系统具有较高的封闭性和自动化程度。技术人员只需将处理后的样品加入反应孔，即可自动完成样品纯化、离心、DNA提取、DNA特异序列检测和自动读取结果。它不仅快速，而且降低生物安全风险，被世卫组织推荐用于结核分枝杆菌检测。此外，研究指出，检测Xpert MTB/RIF的标本有多种，包括咳痰或诱导痰、胃液、支气管肺泡灌洗液、脑脊液、鼻咽分泌物、组织等。本研究采用纤维支气管镜检查技术，不仅可以直接观察病变部位，而且通过标本对病变部位进行肺泡灌洗，解决问题，提高诊断效率。较多的研究提示，支气管肺泡灌洗液的敏感度较高。本研究中，Xpert MTB/RIF在病原学诊断和临床诊断结核的敏感度分别为77%（95%CI：63%～88%）和52%（95%CI：41%～63%）（P<0.05）;肺结核合并支气管结核的敏感度为81%（95%CI：67%～89%），单纯肺结核的敏感度46%（95%CI：35%～59%）;病原学诊断和临床诊断结核、合并支气管结核和单纯肺结核特异度均为100%（95%CI：98%～100%）。Xpert MTB/RIF检测病原学诊断结核敏感度高于临床诊断结核，肺结核合并支气管结核敏感度高于单纯肺结核（P<0.05）;支气管肺泡灌洗液的MTB核酸检出载量病原学诊断结核高于临床诊断结核（P<0.05）。

本研究病原学诊断结核患者中，Xpert MTB/RIF的敏感度为79%。尽管分子生物学原则上具有较高的灵敏度，但在本研究中相对于培养和抗酸染色，仍有假阴性存在。原因主要有，①对病原学阳性的肺结核患儿，均采集各类标本（痰、胃液、支气管肺泡灌洗液等），连续多次采样进行病原学检测。阳性标本经病原学诊断为结核。Xpert MTB/RIF试验仅收集支气管肺泡灌洗液，仅进行一次试验。②Xpert MTB/RIF检测MTB的下限为112.6CFU·mL-1，灵敏度有待进一步提高。因此，Xpert MTB/RIF阴性试验不能排除活动性肺结核，应结合临床进行综合判断。除了现有的试剂盒外，第二代产品Xpert MTB/RIF-Ultra已经用于结核病的诊断。同样，以支气管肺泡灌洗液为供试品，Xpert MTB/RIF比培养4周以上的检测周期，可在2～3h内获得检测结果，对临床早期诊断非常有帮助。如果将Xpert MTB/RIF检测结果作为结核病诊断的依据，可显著提高结核病的诊断率，有助于解决结核病样本细菌载量低的问题。

综上所述，Xpert MTB/RIF檢测法快速、简便、阳性率高，明显优于传统抗酸染色法。对于患者早期肺结核诊断有重大意义。

参考文献

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[2]刘海燕，李曦，孙纪英，邓彬.Xpert MTB/RIF在儿童肺结核肺泡灌洗液检测中的应用[J].现代临床医学，2020，46（05）：327-330.

[3]蔡和伦，李平，董燕，等.经皮肺穿刺活检组织Xpert MTB/RIF对肺结核的诊断价值[J].昆明医科大学学报，2020，41（08）：94-99.

[4]熊梦园，方芳，李一荣.Xpert MTB/RIF检测技术对肺结核的诊断价值[J].海南医学，2020，31（05）：554-558.

[5]李丹，陈丽茹，刘玉洁.气管肺泡灌洗液行Xpert MTB/RIF检测对菌阴肺结核的研究价值[J].贵州医药，2019，43（12）：1867-1870.

[6]王宸，王曼，杜君华，等.Xpert MTB/RIF在儿童肺结核诊断中的研究进展[J].现代检验医学杂志，2019，34（05）：160-164.