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4-(苯乙烯基)苯酚的合成及抗肿瘤活性研究*

2021-08-09姜晓晔黎七雄

化学工程师 2021年7期
关键词:苯基苯乙烯甲氧基

王 璇,姜晓晔,黎七雄

(武汉城市学院 医学部,湖北 武汉 430083)

二苯乙烯类天然产物广泛的存在于自然界中,具有抗菌[1]、抗氧化[2]、抗炎[3]、抗血小板凝聚[4]、抗衰老[5]、保护肝细胞[6]等多种生物活性,而近年来其展现出的抗肿瘤活性尤其引人关注[7-9]。在二苯乙烯类化合物中,白藜芦醇是一个经典的代表药物[10],其在抗肿瘤方面被喻为是继紫杉醇后又一新的绿色抗癌药。然而,白藜芦醇在体内存在抗肿瘤效能低、选择性差、生物利用率低等缺点,使其临床应用受到了严格的限制。因此,开发出新型的、高效的白藜芦醇衍生物,已成为二苯乙烯类抗肿瘤药物研发的一个热点领域。目前,已有众多的白藜芦醇衍生物被报道[11-13],其中部分衍生物的抗肿瘤活性甚至强于白藜芦醇。例如,在2013 年杜成[14]等合成的白藜芦醇衍生物抗HeLa 细胞增殖效果明显的强于白藜芦醇。

在本研究中,我们以(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯为原料,经过Wittig-Homor 反应以及BBr3脱甲基得到了一个白藜芦醇4-(苯乙烯基)苯酚(4),产物结构经过1H NMR 确证。同时考察了影响反应的因素,并优化了反应条件。随后,通过CCK-8 试剂盒评价了4-(苯乙烯基)苯酚对乳腺癌MCF-7、前列腺癌PC-3、宫颈癌HeLa 以及肝癌HepG2 细胞的抗肿瘤活性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

AV400 型核磁共振波谱仪(CDCl3为溶剂,TMS为内标,德国Bruker 公司);OSB-2100 型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司);DZF-1 型真空干燥箱(上海市百典仪器厂);DLSB-10/20 型低温冷却液循环泵(郑州长城科工贸有限公司);SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工有限公司);MS-H-ProA磁力搅拌器(大龙兴创实验仪器(北京)股份公司);ELx800 型酶标仪(美国博腾仪器有限公司)。

(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯、4-甲氧基苯甲醛三溴化硼、N,N-二甲基甲酰胺,均为分析纯,购自百灵威科技有限公司;200~300 目柱层析硅胶,购自青岛海洋化工厂;其他试剂均为市售分析纯。

1.2 实验方法

(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯(1)与4-甲氧基苯甲醛(2)发生Wittig-Homor 反应得到4-甲氧基二苯乙烯(3),(3)经BBr3脱甲基得到目标化合物4-(苯乙烯基)苯酚(4)。合成路线见图1。

图1 4-(苯基乙烯基)苯酚(1)的合成路线Fig.1 Synthetic route of 4-styrylphenol(4)

1.2.1 4-甲氧基二苯乙烯(3)的合成 将原料(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯(1)(45.6g,199.7mmol)溶解到200mL DMF 中,将反应液冷却到0℃,加入甲醇钠(5.0g,998.5mmol),保持低温搅拌10min,再加入4-甲氧基苯甲醛(32.6g,239.6mmol),溶液变成红色,保持室温反应12h。将反应液倾入2L 的冰水中,析出黄色固体,过滤,滤饼真空干燥后用无水乙醇进行重结晶得到白色固体4-甲氧基二苯乙烯(3)(38.4g,91.5%)。产物结构经1H NMR 确证。1H NMR(400MHz, CDCl3)δ 7.46~7.57(m, 4H),7.40(t, J=7.2Hz,2H),7.30~7.35(m,1H),7.14(d,J=16.4Hz,1H),7.12(d,J=16.0Hz,1H),6.91(d,J=8.0Hz,2H),3.89(s,3H)。

1.2.2 4-(苯乙烯基)苯酚(4)的合成 无水无氧并在Ar 保护下,将4-甲氧基二苯乙烯(3)(18.4g,87.5mmol)溶解到200mL 二氯甲烷中,将反应液冷却至-20℃,滴加BBr3(65.7g,262.5mmol),-20℃继续反应12h。在反应液中滴加2mL 的甲醇淬灭反应,再将反应液倾入2L 的冰水中,析出白色固体,过滤,滤饼真空干燥后用无水乙醇进行重结晶得到黄色固体4-(苯乙烯基)苯酚(4)(38.4g,86.9%)。产物结构经1H NMR 确证。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 8.58(s,1H),7.55(d,J=7.6Hz,2H),7.45(d,J=8.8Hz,2H),7.36(t,J=7.6Hz,2H),7.23(d,J=7.6Hz,1H),7.19(d,J=16.8Hz,1H),7.07(d,J=16.4Hz,1H),6.86 (d,J=8.8Hz, 2H)。

1.3 抗肿瘤活性

取对数期的MCF-7、PC-3、HeLa 和HepG2 细胞消化后铺至96 孔板中,用培养基调整每孔的细胞浓度为(8~10)×103个。在37℃5% CO2中培养箱中孵育12h,弃去培养液,加入不同浓度(0, 100, 50,25, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05μM)的4-(苯乙烯基)苯酚(4),继续孵育72h 后弃去培养液,每孔加入20μL CCK-8 溶液和180μL 的培养基,继续孵育4h,在酶标仪上使用470nm 波长读取每孔的吸光度(OD)值,计算出测试4-(苯乙烯基)苯酚的IC50值。

2 结果与讨论

2.1 结构表征

通过1H NMR 对目标化合物4-(苯基乙烯基)苯酚(1)进行了结构表征,见图2。

图2 4-(苯基乙烯基)苯酚(4)的氢谱Fig.2 1H NMR of 4-styrylphenol(4)

由图2 可见,化合物4-(苯基乙烯基)苯酚(4)具有一个-OH,其质子信号出现在低场,8.58×10-6处有一个单峰,并对应1 个H,这就是化合物1 中羟基的质子信号,表明通过BBr3已将4-甲氧基二苯乙烯(3)的甲基顺利脱去,得到了目标羟基化合物1;此外,化学位移在7.19×10-6和7.07×10-6处有两组双峰并各对应1 个H,且其耦合常数均大于16Hz,这是4-(苯基乙烯基)苯酚中乙烯基的2 个质子信号;同时化学位移在7.55×10-6、7.45×10-6、7.36×10-6、7.23×10-6、7.07×10-6和6.86×10-6附近总共出现9 个质子信号,这正是4-(苯基乙烯基)苯酚中两个苯环上9个H 的信号。

2.2 溶剂类型对化合物(3)收率的影响

在第一步Wittig-Homor 反应中,反应溶剂类型可能会影响收率。按照1.2.1 的操作方法,取(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯(1)(1.5g,6.6mmol)溶解到10mL不同溶剂中,再按照n(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯∶n甲醇钠=1∶5,加入甲醇钠(1.8g,33.0mmol)以及4-甲氧基苯甲醛(1.1g,7.9mmol)等反应条件不变情况下,考察溶剂对化合物(3)收率的影响。结果见表1。

表1 溶剂类型对化合物(3)收率的影响Tab.1 Effect of solvent type on the yield of compound(3)

由表1 可见,使用甲醇和乙醇做溶剂时,收率较低,这可能是由于这两种溶剂属于质子性溶剂,影响Wittig-Homor 反应的进行,造成化合物(3)收率低。四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺和18-冠-6-醚属于非质子性溶剂,其在反应中不会游离出质子,性质较稳定,因此,采用这3 种溶剂获得了高收率的化合物(3)。在这3 种非质子性溶剂中又以N,N-二甲基甲酰胺做溶剂获得了最高收率,而N,N-二甲基甲酰胺又易溶于水,可以通过多次水洗将其除去,所以确定此反应中溶剂选用N,N-二甲基甲酰胺最佳。

2.3 碱的类型对化合物(3)收率的影响

在第一步Wittig-Homor 反应中,碱的类型对化合物(3)收率有重要的影响。按照1.2.1 的操作方法,取(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯(1)(1.5g,6.6mmol)溶解到10mL DMF 中,加入5 个单量不同的碱以及4-甲氧基苯甲醛(1.1g,7.9mmol)等反应条件不变情况下,考察碱的类型对化合物(3)收率的影响。结果见表2。

表2 碱类型对化合物(3)收率的影响Tab.2 Effect of base type on the yield of compound(3)

由表2 可见,当甲醇钠作为碱时化合物(3)的收率最高。甲醇钠属于强碱,这表明,强碱可能有利于此反应。的确,当使用另外一种强碱叔丁醇钾时化合物(3)也有高的产率,但随着碱性的降低产率也随之降低,当采用中性的KCl 做催化剂时没有产生化合物(3)。因此,确定此反应中选用甲醇钠最佳。

2.4 物料比对化合物(3)收率的影响

在碱类型筛选实验中,确定了甲醇钠为最佳。接着探讨了n(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯∶n甲醇钠的物料比对反应的影响。按1.2.1 操作方法,取(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯(1)(1.5g,6.6mmol)溶解到10mL DMF 中,加入不同当量的甲醇钠以及4-甲氧基苯甲醛(1.1g,7.9mmol)等反应条件不变下,考察n(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯∶n甲醇钠对化合物(3)收率的影响。结果见表3。

表3 物料比对化合物(3)收率的影响Tab.3 Effect of mole ratio on the yield of compound(3)

由表3 可见,n(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯∶n甲醇钠=1∶5 时,化合物(3)的收率最高;当甲醇钠的当量小于5 时,由于反应不充分造成化合物(3)的产率低;而当甲醇钠的当量大于5 时,化合物(3)的产率也有所降低,这可能是由于过量的甲醇钠引发了副反应造成的,同时考虑到节约试剂成本问题,因此,确定此反应n(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯∶n甲醇钠=1∶5 为最佳投料比。

2.5 反应温度与时间对化合物(3)收率的影响

反应温度与时间对化合物(3)的产率也有一定的影响。按照1.2.1 的操作方法,取(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯(1)(1.5g,6.6mmol)溶解到10mL DMF 中,n(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯∶n甲醇钠=1∶5 以及4-甲氧基苯甲醛(1.1g,7.9mmol)等反应条件不变情况下,考察反应温度与时间对化合物(3)收率的影响。结果见表4。

表4 反应温度与时间对化合物(3)收率的影响Tab.4 Effect of reaction temperature and time on the yield of compound 3

由表4 可见,室温反应12h 时化合物(3)的收率最高;当反应时间缩短为8h,化合物(3)的收率明显降低,这可能是由于反应时间短,反应还未完全;当反应时间延长为24h 时,收率也没有显著地提高;此外,将反应温度由室温降为0℃,此时化合物(3)的收率降低;而当反应温度升高为60℃时,化合物(3)的收率较室温反应也有所降低,这可能是由于随着温度的升高副反应也增加所致。因此,确定此反应为室温反应12h 为最佳。

2.6 脱甲基试剂种类对目标化合物(4)收率的影响

在第二步脱甲基化反应中,脱甲基试剂种类对目标化合物(4)的收率也重要的影响。按照1.2.2 的操作方法,取4-甲氧基二苯乙烯(3)(1.3g,6.2mmol)采用不同的脱甲基试剂和反应条件来考察其对化合物(4)收率的影响。结果见表5。

表5 脱甲基试剂种类对化合物(4)收率的影响Tab.5 Effect of demethylating reagent on the yield of compound(4)

由表5 可见,采用以二氯甲烷作为溶剂、BBr3作为脱甲基试剂,在-20℃下反应脱甲基效果最佳,化合物(4)的产率达到了86.9%,而采用HBr、乙醇钠和AlCl3为脱甲基试剂得到的产率不足30%;尽管采用Al 和I2作为脱甲基试剂能够使得化合物(4)的产率达到84.1%,但考虑到I2是一种有毒物质,容易对身体造成损伤,所以在此反应中BBr3为最佳脱甲基试剂。

2.7 BBr3 的用量对目标化合物(4)收率的影响

在第二步脱甲基化反应中,确定了BBr3为最佳脱甲基试剂,n4-甲氧基二苯乙烯∶nBBr3的物料比可能对化合物(4)也有一定的影响。按照1.2.2 的操作方法,取4-甲氧基二苯乙烯(3)(1.3g,6.2mmol)溶解到15mL二氯甲烷中,-20℃下加入不同当量的BBr3来考察n4-甲氧基二苯乙烯∶nBBr3对化合物(4)收率的影响。结果见表6。

表6 物料比对化合物(4)收率的影响Tab.6 Effect of mole ratio on the yield of compound(4)

由表6 可见,n4-甲氧基二苯乙烯∶nBBr3=1∶3 时,化合物(4)的收率最高;当BBr3的当量小于3 时,由于脱甲基化试剂不够造成化合物(4)的产率低;而BBr3的当量大于3 时,BBr3用于脱甲基量过剩,而BBr3活性高易发生副反应造成产率降低,因此,确定此反应的n4-甲氧基二苯乙烯∶nBBr3=1∶3 为最佳投料比。

2.8 抗肿瘤活性

为了评价4-(苯乙烯基)苯酚4 的抗肿瘤效果,采用了CCK-8 试剂盒测试了其对MCF-7、PC-3、HeLa 和HepG2 这4 种肿瘤细胞的抑制活性。结果见表7。

表7 4-(苯乙烯基)苯酚4 的体外抗肿瘤活性(n=3)Tab.7 Anti-proliferative activity of 4-styrylphenol 4(n=3)

由表7 可见,4-(苯乙烯基)苯酚4 对MCF-7、PC-3、HeLa 和HepG2 肿瘤细胞均展现出了抑制活性,并对MCF-7 有更强的抑制活性,其IC50=(19.9±2.5)μmol·L-1。

3 结论

以(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯(1)为原料,在甲醇钠催化下,与4-甲氧基苯甲醛(2)反应制得4-甲氧基二苯乙烯(3),(3)再经经BBr3脱甲基得到了4-(苯乙烯基)苯酚(4)。产物结构通过核磁共振氢谱表征。

优化了反应条件:在Wittig-Homor 反应中,N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂;甲醇钠为催化剂;n(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯∶n甲醇钠=1∶5;室温反应时间12h;在脱甲基化反应中:BBr3为催化剂;n4-甲氧基二苯乙烯∶nBBr3=1∶3;反应温度为-20℃。优化条件下产物总收率为79.5%。通过生物活性测试表明,4-(苯乙烯基)苯酚对MCF-7、PC-3、HeLa 和HepG2 均展现出了明显的抑制活性。这些结果表明,4-(苯乙烯基)苯酚可作为抗肿瘤先导化合物进行更深入的研究。

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