沈留红， 钱柏霖， 尤留超， 张 钺， 莘 余， 吕尚揆， 肖劲邦， 余树民， 苏柘僮， 董 可， 杨世林， 冯育林，*， 曹随忠，*

(1.四川农业大学 动物医学院，动物疫病与人类健康四川省重点实验室/奶牛疾病研究中心，四川 成都 611130； 2.广西英路维特药物有限公司，广西 荔浦 541000； 3.四川育强本草生物技术有限公司，四川 成都 611130； 4.江西中医药大学 中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌 330006)

奶牛乳房炎是乳腺组织受到物理、化学或生物刺激等因素而引起的炎症反应，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和链球菌等细菌感染是引起奶牛乳房炎的最主要因素。临床型奶牛乳房炎乳腺组织病理变化和临床症状明显，若未及时治疗会转变为慢性乳房炎，导致乳腺纤维化和萎缩，严重危害奶牛生产性能和经济效益。发生初期，病原微生物及其毒性产物直接或间接作用于白细胞和血管内皮细胞，导致C-反应蛋白(CRP)、淀粉样蛋白A(SAA)和结合珠蛋白(HP)水平升高[1]，刺激机体产生白细胞三烯(LT)、前列腺素(PG)、白细胞介素(IL)和肿瘤坏死因子(TNF)等炎性介质参与或引起炎症反应[2-3]，致使乳腺免疫防御屏障受损，大量白细胞和免疫球蛋白(Ig)经血管内皮细胞迁移至乳腺组织，促使乳汁体细胞数(SCC)升高[4]。目前，国内外主要使用各种抗生素防治该病，然而长期、大量反复使用抗生素不仅导致疗效下降、抗生素残留和产生耐药菌株等一系列问题，还严重危害人类健康[5]。为有效配合农业农村部开展的“兽用抗菌药使用减量化行动”，探寻天然高效、无耐药性和乳汁残留的抗生素替代药物极具研究价值。白头翁皂苷B4是白头翁的主要天然成分之一，可抑制金黄色葡萄球菌和链球菌等病原微生物，降低炎性细胞因子表达[6-7]，具有较高的免疫调节活性和较低的细胞毒性[8]，可增强机体的免疫防御功能[9-10]，促进机体恢复至正常生理状态。其抗炎、抑菌和免疫调节等作用与奶牛乳房炎清除细菌、缓解炎症以帮助奶牛自愈的治疗需求密切吻合。为此，特开展本试验，以探究白头翁皂苷B4对临床型奶牛乳房炎的疗效，及其在体内抑制病原微生物和对SCC、血清炎性因子(IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α、LTB4、PGE2、CRP、SAA、HP)与免疫因子(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)的作用，旨在为临床型奶牛乳房炎防治提供数据支持，为进一步研究白头翁皂苷B4的抗炎机制提供理论依据，并为其最终的临床开发和推广应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试验仪器

DHP-9054型电热恒温培养箱，济南欧莱博科学仪器有限公司；ICW190型CO2恒温培养箱，德国爱安姆科技有限公司；DCC型体细胞检测仪，瑞典利拉伐集团公司；TGLB-16G型台式离心机，德国默克公司；DW-86L828W型超低温冰箱，青岛海尔集团；SW-CJ-1F型超净工作台，江苏苏净集团有限公司；Varioskan Flash型全波长多功能酶标仪，美国赛默飞公司；Lambda 45型紫外可见分光光度计，美国珀金埃尔默公司；DZKW-4型电子恒温水浴锅，北京中兴伟业仪器有限公司；LH99186型微量加样器，美国赛默飞公司。

1.2 主要试剂

白头翁皂苷B4注射液(每瓶100 mL，白头翁皂苷B4含量66.67%，乙醇溶液)，PubChem CID：11636713(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/71307558)，由四川英路维特医药科技有限公司惠赠，经江西中医药大学中药固体制剂制造技术国家工程研究中心鉴定。

LB液体培养基、血琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、伊红美兰琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基、PPLO肉汤培养基、PPLO固体培养基、马血清、酵母浸出液和微生物微量生化鉴定管(氧化酶试验、触酶试验、氧化发酵试验、VP试验、甲基红试验、枸橼酸盐利用试验和吲哚试验等)，青岛海博生物技术有限公司；小牛血清，上海士锋生物科技有限公司。

炎性因子IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α、LTB4、PGE2、CRP、SAA、HP和免疫因子IgA、IgD、IgE、IgG、IgM双抗体夹心酶联免疫吸附检测(ELISA)试剂盒，上海酶联生物科技有限公司。

1.3 试验动物与分组

选取某规模化半封闭统一舍饲内体重(612±47)kg、年龄3～4周岁、2～3胎次泌乳高峰期健康和临床型乳房炎中国荷斯坦奶牛各50头，从中选取泌乳天数、产奶量相近的临床检查健康奶牛12头和临床型乳房炎奶牛36头。试验前和试验过程中，供试奶牛自由饮水，统一饲喂，均无其他疾病发生，也未接受抗生素治疗。

将12头健康奶牛作为对照组(A组，不注射药物)，36头临床型乳房炎奶牛(无论几个患病乳区)随机分为低剂量组(B组，0.025 mL·kg-1)、中剂量组(C组，0.05 mL·kg-1)和高剂量组(D组，0.1 mL·kg-1)，每组12头。以临床型奶牛乳房炎发病当天为第1天，除对照组外，每头奶牛均连续6 d颈部肌肉注射白头翁皂苷B4，每日1次，治疗6 d后，无论奶牛是否治愈，均不再用药，并观察临床疗效至第12天。

1.4 样品采集和保存

分别于第1、3、5、7天的上午8:00采集各组奶牛尾静脉血(采样和疗效判定均在用药之前)于无抗凝剂采血管，室温下静置1 h，3 000 r·min-1离心5 min，取上层血清，-70 ℃冻存，待测。

采集各组奶牛第1、7、12天乳汁，采样前用温水清洗乳房，75%乙醇溶液消毒，弃去前3把奶后，人工无菌采集奶样于灭菌试管中，4 ℃保存。

1.5 临床型乳房炎奶牛入选标准

所选奶牛均为自然感染，由牧场同一执业兽医判定，表现典型的临床体征。入选标准如下：感染乳区SCC>50万mL-1，患区乳腺红、肿，触之敏感、不安、躲避等，体温升高，乳腺肿大，泌乳量显著减少或停止，乳汁异常，呈浅黄色或浅红色，稀薄，黏稠或有絮状物[11-12]。

1.6 临床疗效判定

治疗后每日观察奶牛临床症状和乳汁变化情况，判断并记录临床疗效。临床疗效判定标准参照文献[12-13]制定：临床痊愈，患病牛精神食欲恢复正常，乳区红、肿、热、痛等临床症状完全消失，乳汁肉眼观察恢复正常颜色，产奶量基本恢复到治疗前水平；临床有效，患病牛精神食欲基本恢复正常，患病乳区红、肿、热、痛等临床症状减轻或部分消失，乳汁颜色正常或有少量絮状物，泌乳量回升或基本恢复正常；临床无效，患病乳区红、肿、热、痛等临床症状无明显改善或加重，产奶量持续下降，乳汁颜色异常。

1.7 病原微生物分离与鉴定

将各组奶牛第1、12天乳样接种到LB液体培养基，于37 ℃条件下分别有氧、厌氧培养24 h后，无菌接种富集培养物，划线接种于血琼脂平板、麦康凯琼脂培养基、伊红美兰琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基和胰蛋白胨大豆琼脂培养基，再在37 ℃分别有氧和厌氧培养24 h，挑取典型形态菌落纯化培养。

将乳样接种到PPLO肉汤培养基培养支原体，在37 ℃、5% CO2条件下恒温培养3～5 d后，无菌接种至PPLO肉汤培养基传代培养3～4代，观察培养基颜色变化，若培养基由红色变为黄色，将其接种至PPLO固体培养基继续培养3～5 d。

观察分离纯化的细菌菌落形态、染色特征，并进行氧化酶试验、触酶试验、氧化发酵试验、VP试验、甲基红试验等生化反应，鉴定细菌种类。

1.8 试验奶牛SCC和血清炎性因子与免疫因子检测

采用体细胞检测仪检测B、C、D组奶牛第1、7、12天的SCC；严格按照ELISA检测试剂盒说明书检测对照组和最佳剂量组奶牛第1、3、5、7天血清炎性因子IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α、LTB4、PGE2、CRP、SAA、HP和免疫因子IgA、IgD、IgE、IgG、IgM水平。

1.9 数据处理与统计分析

试验数据用SPSS 25.0统计软件进行方差分析，检验不同剂量组和对照组之间SCC、炎性因子和免疫因子水平的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 对临床型奶牛乳房炎SCC的影响

B～D组奶牛的SCC在第1天时差异不显著(表1)，随白头翁皂苷B4治疗时间推进，3组奶牛的SCC均呈下降趋势，在第7、12天时SCC均显著(P<0.05)低于第1天。在第7、12天，B、C组的SCC差异不显著，但C组的SCC显著(P<0.05)低于D组，说明C组的白头翁皂苷B4剂量能更有效地降低临床型奶牛乳房炎的SCC。

表1 不同剂量白头翁皂苷B4对临床型奶牛乳房炎乳汁体细胞数的影响

2.2 对临床型奶牛乳房炎治愈时间和治愈率的影响

B～D组在12 d内的治愈数分别为9、9、11头，有效数分别为3、3、1头，总有效率均达100%，治愈率分别为75.00%、75.00%、91.67%，平均治愈时间分别为6.33、6.11、6.91 d(表2)。试验第6天，C组有6头临床治愈，B、D组均有4头临床治愈；第7天，B、C、D组分别有9、8、9头临床治愈。在超出给药时间后，C、D组分别有1头和2头自愈，B组没有，且B组有1头奶牛复发，而C、D组没有。总的来看，白头翁皂苷B4对临床型奶牛乳房炎的疗效表现出一定的量效关系。

表2 不同剂量白头翁皂苷B4对临床型奶牛乳房炎治愈时间和治愈率的影响

2.3 对临床型奶牛乳房炎乳汁病原微生物的影响

B～D组的36份临床型奶牛乳房炎乳汁样品中，有34份检测出病原微生物，检出率为94.44%，主要为支原体、球菌和大肠埃希菌等。治疗12 d后，病原微生物总转阴率为52.94%，杆菌、产色葡萄球菌、溶血葡萄球菌和大肠埃希菌转阴率达100%，支原体、表皮葡萄球菌和球菌转阴率分别为69.23%、50.00%、33.33%，金黄色葡萄球菌、阿尔莱特葡萄球菌、腐生葡萄球菌和葡萄球菌转阴率均为0(表3)。

表3 不同剂量白头翁皂苷B4对临床型奶牛乳房炎病原微生物的影响

2.4 对临床型奶牛乳房炎血清炎性因子的影响

试验第1天，临床型奶牛乳房炎血清炎性因子CRP、SAA、HP、LTB4、PGE2、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α的水平均显著(P<0.05)高于对照组(表4)。随治疗时间推进，临床型奶牛乳房炎血清炎性因子均呈逐渐下降趋势，第7天除LTB4和PGE2水平仍显著(P<0.05)高于对照组外，其余检测指标均与对照组无显著差异。

表4 白头翁皂苷B4对临床型奶牛乳房炎血清炎性因子的影响

2.5 对临床型奶牛乳房炎血清免疫因子的影响

试验第1天，临床型奶牛乳房炎血清免疫因子IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的水平均显著(P<0.05)高于对照组(表5)。随治疗时间推进，临床型奶牛乳房炎血清免疫因子水平均呈现逐渐下降趋势，至第7天时，均与对照组无显著差异。

表5 白头翁皂苷B4对临床型奶牛乳房炎血清免疫因子的影响

3 讨论

本研究发现，以0.05 mL·kg-1·d-1的剂量连续6 d肌肉注射白头翁皂苷B4，可有效治疗临床型奶牛乳房炎，临床治愈率达75.00%以上，总有效率达100%。该方法对治疗前后乳汁中的病原微生物具有明显的抑制和杀灭作用，可显著降低SCC，促使临床型奶牛乳房炎血清中的炎性因子和免疫因子恢复到正常水平，是治疗临床型奶牛乳房炎的理想药物。

3.1 白头翁皂苷B4对临床型奶牛乳房炎SCC和疗效的影响

抗生素是奶牛场治疗奶牛乳房炎的首选药物，然而大量和不规范的使用，造成病原菌耐药性增加，疗效下降。中兽药具有疗效显著、低毒、低残留和不易使病原菌产生耐药性的特点，近年来受到国内外学者的广泛关注。研究表明，众多中药组方可抑制临床型奶牛乳房炎乳汁大肠埃希菌、无乳链球菌等病原菌，显著降低乳汁SCC，提高淋巴细胞刺激指数，激活嗜中性粒细胞活性，加速受损乳腺组织修复，对临床型奶牛乳房炎有很好的疗效[14-15]；但关于单味中药提取物，且以注射方式给药治疗临床型奶牛乳房炎的还未见研究报道。本试验选取白头翁天然提取成分——皂苷B4治疗临床型奶牛乳房炎，发现中剂量下降低SCC的效果最好。各剂量组疗效接近，但低剂量组可能由于剂量偏低，1头奶牛复发，导致未完全治愈，中、高剂量组都未见复发，但高剂量组平均治愈时间最长。连续高剂量注射不仅增加医疗成本，还会导致奶牛注射应激反应。综合分析，临床推荐中剂量即可达到理想疗效。目前，大多牧场无法检测致病菌种类和抗菌药物的耐药性，导致抗生素盲目滥用，诱发乳汁药物残留、细菌耐药性等问题，严重危害人类健康。另外，使用抗生素后的休药和弃奶，也严重影响牧场效益[16]。白头翁皂苷B4作为纯天然中药提取物，对临床型奶牛乳房炎疗效明显，不易产生细胞毒性[8]和细菌耐药性，更重要的是，不会造成乳汁药物残留和治愈后休药期弃奶。该制剂的推广使用，对未来奶牛乳房炎治疗中减少和替代抗生素使用将起到重要的推动作用。

3.2 白头翁皂苷B4对临床型奶牛乳房炎乳汁病原微生物的影响

奶牛乳房炎主要由大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、链球菌等病原菌入侵乳腺组织，释放脂多糖和外毒素等毒性物质导致。众多天然皂苷类物质表现出良好的抑菌作用。白头翁皂苷可抑制金黄色葡萄球菌和链球菌等病原微生物，并能降低促炎细胞因子的表达[6-7]；茶皂苷可抑制奶牛乳房炎无乳链球菌生长和生物膜形成[17]；藜麦皂苷对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌、肠炎沙门氏菌等病原微生物具有抑制作用[18]。本试验中，临床型奶牛乳房炎经白头翁皂苷B4治疗后，乳汁中大肠埃希菌、产色葡萄球菌和溶血葡萄球菌等病原微生物的转阴率达33.33%～100%。这些病原微生物均存在于乳腺中，白头翁皂苷B4可能是通过降解病原微生物细胞壁、破坏细胞膜和膜蛋白，引起细胞内容物外泄，从而对病原微生物造成损伤的[19]。支原体不具细胞壁，通过膜蛋白黏附在宿主细胞上，其膜上的相关核酸酶可降解噬菌体和质粒，抑制中性粒细胞发挥杀灭作用，实现免疫逃避，导致抗生素对支原体性乳房炎无效。本试验结果显示，白头翁皂苷B4对支原体的抑制效果明显，可能是其通过降低炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达[20]，同时促进免疫细胞分泌细胞因子，增强中性粒细胞吞噬功能，从而提高了奶牛机体自身对支原体的抑制作用[10]。

3.3 白头翁皂苷B4对临床型奶牛乳房炎血清炎性因子和免疫因子的影响

细胞因子在免疫防御和炎症过程中发挥重要作用。奶牛发生乳房炎时，在细菌及其毒性产物的刺激下，机体免疫细胞合成并释放各种炎症因子，从而导致上皮细胞凋亡、细胞屏障破坏，产生明显临床症状。本研究表明，奶牛患临床型乳房炎后，炎性因子HP、SAA、CRP、PGE2、LTB4、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α水平显著高于健康奶牛，与众多学者的研究结果一致[21-23]。白头翁汤及其主要成分可显著抑制内毒素诱导的内皮细胞体外高水平分泌IL-1α、IL-6和ET-1等，具有潜在的抗细菌内毒素作用[24]。白头翁皂苷B4可下调溃疡性结肠炎小鼠体内外IL-1β、IL-6和TNF-α释放，发挥抗炎和免疫调节作用[25]。本研究中，白头翁皂苷B4可显著降低临床型奶牛乳房炎血清HP、SAA、CRP、PGE2、LTB4、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α水平，与上述学者的研究结果一致，说明白头翁皂苷B4可通过抑制炎性因子表达起到治疗奶牛乳房炎的作用，而其调控炎症相关的信号通路则有待今后进一步深入研究。

3.4 白头翁皂苷B4对临床型奶牛乳房炎血清免疫因子的影响

IgA、IgG和IgM是血清中免疫球蛋白的主要成分，在结合补体、增强免疫细胞吞噬病原微生物和中和细菌毒素等方面具有重要的作用[26]；IgD可与IgM共同影响B细胞早期发育和抗原识别[27]；IgE在一定范围内可提高免疫力，抵御病原入侵和调节机体炎症反应。各免疫因子共同作用，维持机体免疫防御功能[28]。研究表明，白头翁和白头翁皂苷可显著升高断奶仔猪IgG和IgM水平，增强机体免疫功能和抗氧化性能[10]。甘草皂苷可显著提高羊IgA和IgG水平[29]。本试验结果显示，使用白头翁皂苷B4治疗后，临床型奶牛乳房炎血清IgA、IgG、IgM、IgD和IgE水平随治疗时间推进呈降低趋势，与上述研究结果不一致。这可能是因为，虽然免疫因子在机体正常免疫应答时发挥重要作用，但当其异常或过高表达时则可导致超敏反应，造成抗体依赖性细胞毒性作用并继发细胞损伤[30]。