＊解恒杰 徐立清 徐大玮 穆文婕 张洪潇 姜大勇 刘佩*

（1.山东省食品药品检验研究院 山东 250100 2.山东省食品药品安全检测工程技术研究中心 山东 250100）

前言

叶黄素是一种广泛存在于蔬菜、花卉、水果等植物中的天然物质，属于类胡萝卜素的一种，是构成人眼视网膜黄斑区域的主要色素。叶黄素对视网膜中的黄斑有重要保护作用，是帮助眼睛发育的关键营养元素，而且人体无法通过自身合成，必须靠摄入叶黄素来补充。新生儿眼睛中的高氧张力及视网膜中存在高浓度易氧化基质，在光和光敏物质作用下，婴儿的视网膜更加容易受到氧化损害，叶黄素作为抗氧化剂，能够有助保护视网膜免受氧化损害。在我国食品营养强化剂使用标准中规定调制乳粉中叶黄素含量在1620μg/kg-2700μg/kg，婴儿配方食品和特殊膳食用食品中含量在300μg/kg-2000μg/kg，较大婴儿和幼儿配方食品中含量在1620μg/kg-4230μg/kg，目前保健食品中叶黄素含量还没有规定使用量。

目前检测叶黄素的方法主要有分光光度法[1-3]，紫外分光光度计法[4]，液相色谱串联质谱法[5]，薄层扫描法测定[6]，液相色谱法[7-10]。分光度法、紫外分光光度法和薄层扫描法样品基质易产生干扰，定性定量稳定性差，液相色谱串联质谱法对于常量添加水平的叶黄素定量不准确，高效液相色谱法稳定性好，灵敏度高。样品前处理方法主要有：丙酮直接提取法[11]；水溶解样品后液液萃取法[12]；样品皂化，蛋白酶酶解后进行液液萃取；国家标准中对于脂肪含量高的样品经氢氧化钾溶液皂化后，再以乙醚-正己烷-环己烷（40+40+20，体积比）提取，液相色谱法分离，紫外检测器检测，外标法定量。实际试验中发现皂化后加入混合萃取溶剂后离心时存在液液分层不明显，不容易取出有机层；合并提取两次提取液水洗后浓缩近干时较粘稠，不易浓缩近干。按照国标前处理方式进行实验，效果不好，本文建立了快速简单的前处理方法，稳定可靠，操作简单，实验结果良好。

1.实验部分

(1)材料与试剂

甲醇（色谱纯），美国飞世尔公司；甲基叔丁基醚（色谱纯），德国Merk公司；2,6-二叔丁基甲醚（分析纯），中国天津科密欧化学试剂有限公司；盐酸（分析纯），中国国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯），中国国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钾（分析纯），中国国药集团化学试剂有限公司；叶黄素标准物质（纯度：≥98%），中国计量科学研究院；有机相滤膜，上海安谱科学仪器有限公司。

(2)仪器与试剂

Alliance 2695型高效液相色谱仪配2998型二极管阵列检测器，美国Waters公司；BSA822-cw型电子天平，德国Sartorios公司；AB204-S型电子天平，瑞士Mettler Toledo公司；MS3基本型旋涡混合器，德国IKA公司；SB-800DTD型超声波清洗器，中国宁波新芝生物科技股份有限公司；3-18K型冷冻离心机，德国Sigma公司；Milli-Q超纯水制备器，美国MILLIPORE公司；HGC-24型氮吹仪，中国HENGAO公司。

(3)标准溶液配制

①校正标准溶液

称取叶黄素标准样品5mg（精确至0.01mg）于100mL容量瓶中，以0.1%BHT乙醇溶液配制成浓度约为50μg/mL标准储备液。标样校正用含0.1%BHT乙醇配制50μg/mL叶黄素标样，用甲醇稀释得到10ug/mL标样，取1mL用甲醇定容至10mL，在波长445nm下校正，校正公式：

式中，A-标准溶液的吸光度值；E-甲醇中叶黄素的吸光度系数，为2629dL/g；10-稀释倍数；10000-换算系数（g/dL转化为μg/mL）。

②配制标准工作溶液

用移液管移取适量的标准储备溶液用甲醇（含0.1%BHT）依次稀释成0.01ug/mL、0.05ug/mL、0.1ug/mL、0.5ug/mL、1.0ug/mL、2.0ug/mL的标准系列溶液。

(4)高效液相色谱条件

色谱柱：YMC C30，5μm，250mm×4.6mm；柱温：35℃；流速：1.0mL/min；检测波长：445nm；进样量：50μL；流动相：甲醇（含0.1%BHT）-甲基叔丁基醚（含0.1%BHT）梯度洗脱，0-18min甲醇（含0.1%BHT）由95%～10%，18.1min甲醇（含0.1%BHT）变为95%，保留10min。

(5)样品处理方法

称取2.00g样品加0.2g BHT，加5mL 50%（质量浓度）KOH，涡旋分散均匀，加10mL无水乙醇在35℃水浴振荡45min，取出后冷至室温，用无水乙醇定容至20mL摇匀，取5mL上述定溶液加1.8mL 6mol/L HCl（调pH至9），并用乙醇定容至10mL，过膜上机。经0.22μm的有机滤膜过滤，滤液供高效液相色谱仪测定。

2.结果与讨论

对质量含量较高的样品前处理方法进行改进，并对其中关键控制技术进行研究抗氧化剂使用量、pH值和碱液浓度进行深入研究，建立准确测定高脂肪保健食品中叶黄素含量方法，该方法前处理简单快速，结果稳定可靠。

(1)BHT使用量的优化

游离态叶黄素长时间在空气中暴露容易被氧化，会造成目标物提取含量降低。因此在实验过程中需要加入抗氧化剂BHT，避免目标物被氧化从而造成含量降低。BHT含量不同有不同的抗氧化作用，使用量太少起不到抗氧化的效果，含量太高容易造成试剂浪费。在阴性样品中添加叶黄素，分别加入0.05g、0.1g、0.2g、0.3g、0.5g BHT，叶黄素提取回收率如图1所示，在BHT加入量小于0.2g时回收率较低，可能有存在部分目标物被氧化，当BHT加入量达到0.2g时回收率能达到近100%，大于0.2g时，回收率趋于稳定，因此选择抗氧化剂0.2g BHT最合适。

图1 BHT使用量对叶黄素提取回收率的影响

(2)KOH浓度的选择

实验中皂化过程需要使用KOH，其作用是使脂肪生成脂肪酸钾，容易溶解于水中，加入量的多少会直接影响提取效率。加入量过少，将会皂化反应不完全，目标物提取不充分，导致结果偏低。分别考察KOH质量浓度为10%、30%、50%、70%和90%时，对阳性样品中叶黄素皂化提取效率进行研究，结果见图2所示。当KOH浓度低于50%时阳性样品叶黄素提取效率低于60%，样品并未完全被皂化，因此提取效率较低。当KOH浓度达到50%以上时，样品中叶黄素提取效率接近100%，样品能够被完全皂化，提取效率较高。因此选择KOH浓度为50%作为样品皂化条件。

图2 KOH浓度对样品中叶黄素提取效率影响

(3)pH值的优化

为了考察叶黄素的稳定性，试验了pH分别为3、5、7、9和12时，研究叶黄素含量提取效率，结果见图3所示，当pH大于等于9时，提取效率较高且稳定，相对标准偏差较小，但当pH为7时，叶黄素提取效率高，相对标准偏差较大。通过实验发现，皂化后的提取溶液调节pH值为9时，测定结果稳定。

图3 pH对样品中叶黄素提取效率影响

(4)稳定性试验

为了考察叶黄素的稳定性，分别对叶黄素标准溶液和样品提取溶液进行实验，叶黄素标准溶液（浓度为0.06μg/mL）在18h内每隔3h测定一次，记录峰面及变化值结果见表1所示。实验结果表明标注溶液和阳性样品提取溶液在18h内叶黄素响应值没有显著变化，相对标准偏差分别为0.58%和0.24%，测定结果稳定。

表1 叶黄素溶液稳定性实验

(5)方法学考察

①线性范围和检出限

将标准工作溶液按照浓度从低到高依次经高效液相色谱法测定，以叶黄素标准工作溶液浓度为横坐标，以响应值为纵坐标，绘制叶黄素标准工作曲线，标准工作溶液在0.02μg/mL～2.0μg/mL范围内，线性关系良好，线性回归方程为：y=6.37×105x+1550，线性相关系数为0.9999。本文采用加标空白样品基质中标样对应的响应与背景噪音的比值（S/N=3）计算得到叶黄素的方法检出限为10μg/100g，当S/N=10时，方法定量限为40μg/100g。

②精密度

对不同保健食品添加165μg/100g，330μg/100g，660μg/100g三个含量水平标物，每个含量水平重复6次，结果见表2所示。样品含量在43-410μg/100g内，回收率在87.9%-107%范围内，相对标准偏差在1.6%-3.5%范围内。

表2 加标回收率结果（n=6）

3.结论

在高效液相色谱法测定高脂肪保健食品中叶黄素含量，对其中关键条件进行优化；抗氧化剂使用量，KOH质量浓度和pH优化。通过对关键因素进行考察，确定了最佳实验条件：抗氧化剂BHT使用量0.2g，皂化KOH碱溶液质量浓度为50%，最佳pH提取溶液为9，在最优条件下，标准溶液和提取溶液18h内含量稳定。经过验证，该方法适用于含乳保健食品中叶黄素含量的测定，前处理条件简单快速，结果准确可靠，重现性好。