秦健辉，李金桥，赵旭，李克斌，曹雅忠，尹姣

铜绿丽金龟气味结合蛋白AcorOBP11的表达纯化及功能分析

秦健辉，李金桥，赵旭，李克斌，曹雅忠，尹姣

中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193

【】通过研究铜绿丽金龟（）气味结合蛋白11（odorant binding protein 11，OBP11）与寄主植物挥发物的结合特性，探讨AcorOBP11的功能，为阐明铜绿丽金龟识别寄主植物的嗅觉分子机制打下基础。设计特异性引物，通过RT-PCR克隆，分析其序列特征并与相似序列进行对比；将目的基因连入原核表达载体pET28a后，重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)。利用IPTG诱导AcorOBP11重组蛋白的表达，超声破碎菌体，取上清液过镍柱，利用重组肠激酶切除his标签后再次过镍柱纯化获得目的蛋白；纯化后的蛋白以1-NPN为荧光探针开展荧光竞争结合试验，测定AcorOBP11蛋白与37种寄主植物挥发物的结合特性；利用Modeller对AcorOBP11进行同源建模，以冈比亚按蚊气味结合蛋白AgamOBP48（PDB ID：4ij7）作为模板，获得其三维结构；利用Autodock半柔性对接将蛋白与化合物对接，模拟AcorOBP11与6种候选寄主植物挥发物的结合情况。克隆获得了全长基因，开放阅读框共639 bp，N末端有17个氨基酸组成的信号肽，具有8个保守的半胱氨酸位点，属于Plus-C OBP亚家族，进化树结果表明其与HparOBP9进化关系最近。成功连入pET28a表达载体，在0.25 mmol·L-1IPTG、37℃条件下诱导表达，并通过两次镍柱纯化得到目的蛋白。竞争结合试验结果表明，AcorOBP11结合谱较广，对-紫罗兰酮、异戊醛、丙烯酸-2-乙基己酯、乙酸龙脑酯、柠檬烯、反-2-己烯醛、2-乙基己醛、异戊酸等13种寄主植物挥发物有较好的结合能力。……