寇美玲，谢佳芮，杨振兴，苗海生

（云南省畜牧兽医科学院，云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650224）

流行性出血热（epizootic hemorrhagic disease，EHD）是由流行性出血热病毒（epizootic hemorrhagic disease virus，EHDV）引起的，通过库蠓传播的非接触性虫媒病毒病，主要引起鹿（尤其是白尾鹿）体温升高，黏膜和浆膜面广泛出血，甚至休克致死，也可引起牛发病[1]，主要分布在热带、亚热带和温带地区。2013—2018 年，山西、内蒙古、广东、广西等地区均有检测到EHDV 阳性血清的报道[2-5]。EHD 目前尚无有效的疫苗和治疗方法，其暴发流行会给畜牧业带来巨大损失[6-7]。为了解云南省EHD 流行情况及病毒血清型分布情况，2019 年在多个县（市）采集牛血清样品进行EHDV 检测，以期为我国EHD 的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 待检样品

在云南省5 个地州11 个县市（芒市、瑞丽、景洪、勐腊、富宁、沾益、西盟、江城、沧源、镇康、耿马）采集牛血清样品。每个县市先按采样点所属地理位置划定采样区域，再将区域内的养殖场、活畜交易市场和散养户分别编号，然后根据场户数量，随机抽取养殖场1～6 个、活畜交易市场个1～2个、散养户3～29 个进行样品采集。样品采集地优先选择年均降雨量多、年均日照时间长、相对湿度大、适于媒介昆虫库蠓生长繁殖的热带、亚热带地区。具体样品采集工作由当地县级动物疫病控制机构负责，共采集1 199 份牛血清样品（表1）。

表1 2019 年云南省11 个县市采样信息统计结果 单位：个/份

1.2 病毒

EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8、-10 型 参 考病毒，由澳大利亚麦克阿瑟‧伊丽莎白农业研究所（Elizabeth Macarthur Agricultural Institute，EMAI）提供。

1.3 C-ELISA 抗体检测

按照EHDV C-ELISA 试剂盒说明书，对待检血清进行检测。取40 μL 稀释液加入EHDV 抗原包被的ELISA 板中，分别取10 μL 被检血清样品、阳性对照、弱阳性对照和阴性对照血清，加入到相应检测孔和对照孔中，用振荡器震荡或轻拍微量反应板；将反应板中的液体充分混匀，37 ℃温箱温育30 min；取出板，每孔加入50 μL 1/100 稀释的竞争抗体，充分混匀，37 ℃温箱温育30 min；取出板，倒掉孔中液体，在吸水纸上拍干；每孔加入50 μL 1/100 稀释的羊抗豚鼠HPR 酶标二抗，充分混匀，37 ℃温箱里温育30 min；取出板，洗板5～6 次拍干，加入TMB 显色液50 μL/孔，37 ℃避光温育10 min；最后加入终止液50 μL/孔，用ELISA 读板仪450 nm 波长测定样本和对照的吸光值OD450

[8]。试剂盒质控标准：两个阳性对照孔OD450≤0.20，两孔间OD450差值＜0.05，两个阴性对照孔OD450≥1.00 且＜1.60，两孔间OD450差值＜0.20。判定标准：按照抑制率（PI）=（阴性对照OD450平均值-样品血清OD450）/阴性对照OD450平均值×100%。抑制率≥50%判为抗体阳性，否则为阴性。

1.4 血清型鉴定

从各地C-ELISA 检出的阳性样品中，随机抽取18～50 份，利用EHDV 标准毒株进行微量血清中和试验（SNT），同时参照国家标准GB/T 18636—2017[9]，按Karber 方法计算EHDV 7 个血清型标准毒株的半数感染量（TCID50），以确定阳性血清样品的血清型。

1.5 检测结果分析

采用SPSS 22.0 软件统计各地EHDV 抗体阳性率，分析各地EHDV 主要流行毒株血清型。

2 结果与分析

2.1 血清抗体检测

应 用EHDV C-ELISA 试 剂 盒，对 云 南 省11 个县市1 199 份牛血清样品进行抗体检测，检出EHDV 抗体阳性血清981 份，抗体阳性率为81.8%，各县市均检测到抗体阳性血清，表明牛EHDV 感染在云南省普遍存在且较严重。各地EHDV 抗体阳性率有所差异，其中芒市最高，阳性率达91.3%，耿马县最低，抗体阳性率仅为49.3%。具体检测结果见表2。

表2 2019 年云南省牛EHDV 血清抗体检测统计结果

2.2 场群分布

对抗体检测结果进行场群分布统计，发现养殖场阳性率较高，其次是活畜交易市场，散养户最低，但不同采样场群抗体阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）。具体结果见表3。

表3 不同采样场群的抗体阳性样品分布

2.3 血清型鉴定

从每个县市的血清检测阳性样品中，随机挑选18～50 份与EHDV 7 个血清型标准毒株进行SNT 检 测。结果（表4）显 示：EHDV-7、-10、-6、-5 血清型检出率较高，依次为25.2%、23.2%、22.2%、15.4%，EHDV-8、-2 血清型检出率较低，依次为6.3%、1.8%，仅在勐腊县检测到EHDV-2 型，未检出EHDV-1 型；各县市普遍存在3 个及以上的EHDV 血清型，其中勐腊县、江城县最多（6 个血清型），其次是芒市、瑞丽市、景洪市、富宁县、沾益县、沧源县、镇康县（4 个血清型），而西盟县、耿马县较少（3 个血清型）。

表4 血清检测阳性样品中7 个血清型的中和抗体鉴定结果

3 讨论

本研究所调查的云南省11 个县市均位于热带或者亚热带地区，年均气温较高，降雨量较多，年均日照时间也较长，适于各类库蠓生长和繁殖，因而有利于EHDV 传播，说明其流行具有地域性；采集血清的牛均未注射过EHDV 疫苗，因而血清阳性率可以反映出牛的自然感染情况；对牛血清样品进行EHDV C-ELISA 检测发现，除耿马县（49.3%）外，其余县市抗体水平均较高，阳性率均在69.6%以上，说明EHDV 在云南省流行广泛且较为严重。不同采样场群的血清样品EHDV 抗体阳性率差异不显著（P＞0.05），说明云南省不同场点的EHDV 流行态势相似，这可能与云南省不同场点的环境特征、传播媒介类似有关[10]。

本研究调查了EHDV 的7 个血清型，结果发现各县市均存在3 个及以上血清型的流行，其中勐腊、江城2 个县血清型最多，有6 个血清型。EHDV 的流行与传播媒介库蠓的种类和移动转播有关，从而引起新血清型传入，导致多种血清型同时存在[10]。在血清型鉴定中发现，富宁县、西盟县、镇康县等地均存在同一份阳性血清样品检出至少2 种血清型情况，说明云南省存在多种血清型病毒的混合流行。EHDV 血清型之间无交叉保护[11]，这给EHD 防治带来了困难。血清型鉴定发现，部分血清检测阳性样品未检出上述7 个血清型，说明云南省可能存在7 个血清类型以外的其他血清型，也进一步说明云南省流行的EHDV 血清型更加复杂，具体需要进一步研究。

尽管我国未见牛和鹿发生EHD 临床病例的报道，但对牛有较强致病力的EHDV-2、-6、-7 型毒株均分离到[12-13]。调查发现，云南省11 个县市中，EHDV-6、-7 血清型阳性数量较多，说明云南省有发生该病的风险，需要引起动物防疫部门和养殖户的重视。1959 年首次在日本茨城发现EHDV-2 型毒株导致牛发病，病死率达10.3%，将之命名为茨城病[14]。此次在勐腊县也检测到EHDV-2 型，提示应加强对该地区的持续监测。

通过对云南省11 个具有地域代表性县市的牛血清进行检测和鉴定，发现各地均存在EHDV 多种血清型流行，且抗体阳性率普遍较高，这需要引起疫病控制机构和养殖人员的足够重视。

4 结论

调查发现，EHDV 在云南省流行广泛且较严重，流行血清型复杂，需持续开展血清学监测，加强该病防控。