高豪，陆家声，章文明，2，董维亮，2，方艳，2，余子夷，信丰学，2，姜岷，2

（1 南京工业大学生物与制药工程学院，材料化学工程国家重点实验室，江苏南京 211816；2 南京工业大学，江苏先进生物与化学制造协同创新中心（SICAM），江苏南京 211816；3 南京工业大学化工学院，江苏南京 211816）

固定化细胞是指固定在水不溶性载体上且能在一定的空间范围进行生命活动的细胞。现代固定化细胞技术是在固定化酶技术的推动下发展起来的[1]。该技术被定义为把游离细胞通过化学或物理手段固定在限域空间内，以减少外界不良环境对生物体的影响[2]，使其尽可能保持旺盛的代谢活性，且能被重复和连续使用的一种新兴生物技术。细胞固定化技术在生物技术领域已经显示出巨大的应用潜力。比如，固定化细胞生物反应器因可以缓解高浓度底物和产物对细胞产生的抑制作用，已经在生物发酵领域中得到了广泛的应用[3-4]。

为了提高固定化细胞在生物发酵领域中的应用，本文分析了生物发酵中应用的各种固定化材料，特别是膜材料（中空纤维膜和微米/纳米纤维膜）的最新进展，并对材料介导细胞固定化技术在微生物多细胞培养体系中的应用前景进行了展望。

1 固定化材料

根据其化学组成不同，固定化材料可分为高分子载体材料、无机载体材料和复合载体材料3类。其中，高分子材料中的膜材料有良好的力学性能和易于调节的特性，在细胞固定方面已经引起了国内外研究人员的广泛关注[5]。在利用膜材料作为固定化材料时不仅需要考虑到其力学性能和稳定性等特点，也要考虑到材料表面粗糙度、亲水性以及是否具有良好的生物相容性等。通过调节固定化载体材料的表面化学性质已被证明可以提高固定化细胞的活性和稳定性。比如，多糖物质是一种具有特异生物学功能的多羟基碳水化合物，将糖基固定于高分子聚合物膜表面，不仅可提高膜表面的生物相容性，而且能赋予其更多特殊的生物学功能（见图1）。

1.1 高分子载体材料在生物发酵领域的应用

1.1.1 天然有机高分子载体材料

图1 膜表面糖基化处理用于浸入式固定化发酵

表1 利用天然高分子材料固定细胞进行生物发酵

天然有机高分子材料主要包括来源于生物体内（胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸）或生物体外的物质（壳聚糖、海藻酸盐）（见表1）。它们具有一般对生物无毒、传质性能较好和具有良好的生物相容性等优点。常见的天然有机高分子载体材料有海藻酸钠、果胶和壳聚糖等，已被广泛应用于生物发酵系统中。例如，海藻酸钠可应用于固定由热纤维梭菌（Clostridium thermocellum） 和热解糖梭菌（C.thermolacticum）组成的共培养系统中，提高了以木质纤维素为底物生物乙醇的发酵性能[6]。与游离细胞发酵相比，固定化细胞发酵生产乙醇的产量提高了60%以上[6]。当以木质纤维素水解液为底物时，碱预处理过程中产生的有毒物质和高pH会对细胞生长和代谢产生抑制作用，导致乙醇产量和收率降低[6]。海藻酸钠固定化可通过物理包埋细胞形成微球，微球核心中可包埋C. thermocellum和C.thermolacticum。这种通过空间隔离的方式可使细胞免受发酵体系中有毒物质的毒害，同时可提高细胞对pH 变化的适应能力[6]。 干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）可利用果胶酸钙为固定化载体生产乳酸，实现了乳糖的高转化率（94.37%），且在16 批乳糖转化为乳酸的发酵过程中保持稳定[7]。当粪肠球菌（Enterococcus faecalis）以壳聚糖为固定化载体时，实现了以L-精氨酸为底物大规模生产L-瓜氨酸。其中，在工业生产规模上，1000kg的L-精氨酸可转化为974.6kg的L-瓜氨酸[8]。同时，固定化细胞也可有效缓解搅拌器对细胞膜的损伤，细胞的力学性能可得到显著改善。如在利用固定化细胞转化L-精氨酸合成L-瓜氨酸过程中，经过5 批发酵后产物收率仍高达98.9%，而游离细胞在第二批的收率仅有68.2%[8]。

天然有机高分子载体材料在固定细胞过程中也存在一些缺点，如机械强度较低、弹性差、在厌氧条件下易被微生物分解等。海藻酸钠是由两个重复羧基化单糖单元组成的多糖主链，其结构中含有羧基和羟基[9]。然而，由于现有的羧基和羟基在发酵过程中可以结合过量的水，这会显著降低其机械强度。固定化颗粒的软化和分解会影响细胞固定化的效率，导致生物发酵性能降低。在不影响生物相容性的情况下，通过化学改性引入更强的聚合物主链等方法可提高固定化材料的机械强度。如Zhang等[10]为了解决天然聚合物材料机械强度较低的问题，在海藻酸中加入适量的壳聚糖或Al2O3制备了新的细胞固定化载体，避免了海藻酸凝胶的分解、软化和漂浮问题。吴亚杰等[11]在海藻酸凝胶球中添加无机材料粉末活性炭、SiO2、CaCO3和人造沸石，改善海藻酸凝胶球的机械强度。其中添加粉末活性炭能提高凝胶球的压缩强度；添加SiO2能提高凝胶球的密度；添加CaCO3能提高凝胶球的传质性能；添加人造沸石能提高凝胶球的抗拉强度。

1.1.2 人工合成有机高分子载体材料

人工合成有机高分子载体材料是人工合成的具有长链结构的有机材料，常见的有聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚氨基酸和聚乙烯醇等（见表2）。它们的特点是抗微生物分解性好、机械强度高和稳定性强等。其中，聚酰胺基质的多孔珠状材料可用于丙酸杆菌（Propionibacteriumsp.）的固定化，并提高了以葡萄糖为底物生产丙酸的发酵性能[14]。与游离细胞发酵相比，固定化细胞发酵无滞后期，在底物浓度为40g/L 时，丙酸产量提高了26.5%。聚酰胺是分子主链上含有酰胺基团的高分子化合物，氢键的存在使其具有较高的机械强度。在重复发酵过程中，微珠在搅拌和酸性条件下都具有很高的稳定性，且与细胞结合的微珠即使经过长时间的保存也能继续作为接种剂，这在细胞保存方面具有相当大的优势。但缺少聚酰胺材料促进细胞吸附的自由官能团，细胞不能更好的吸附，可通过聚阳离子聚醚酰亚胺（PEI）进行微珠的修饰，以增强聚酰胺材料与细胞的电荷相互作用。F127-甲基丙烯酸双脲酯（F127-BUM）水凝胶在单细胞培养和多细胞共培养中可重复使用，并具有较强的稳定性（见图2）[15]。在单细胞培养过程中，负载S.cerevisiae的水凝胶在以葡萄糖为底物发酵产乙醇时，长达一年的过程中，所有菌株生物发酵仍可运行，表明这些水凝胶材料具有较好的稳定性[15]。在多细胞共培养体系中，上游大肠杆菌（Escherichia coli）可利用葡萄糖合成中间体3，4-二羟基苯丙氨酸，该中间体随后被下游酿酒酵母（S.cerevisiae）代谢转化为甜菜黄素[15]。与游离细胞发酵相比，在5 次重复使用后，固定化细胞仍保持了100%的甜菜黄素产量，而游离体系很快失去了产生甜菜黄素的能力。水凝胶固定化细胞的另一个优势在于能够通过改变细胞装载凝胶的比例来控制所需的细胞组成，从而解决生物合成能力不平衡的问题。例如，在E. coli/S.cerevisiae的共培养体系中，不同菌株的生长速率和底物代谢能力不同，这会导致菌群的结构和比例难以有效调节，导致微生物共培养系体的稳定性和可控性差。通过水凝胶固定化细胞技术，可在空间上控制不同菌株，如E.coli∶S.cerevisiae为1∶6时，空间上调控共培养体系中不同微生物菌株的比例可将甜菜黄素的产量提高100%[15]。

表2 利用人工合成高分子材料固定细胞进行生物发酵

细胞固定化技术也可与3D打印技术进行结合。例如，利用F127-二甲基丙烯酸酯（F127-DMA）作为包埋材料，3D 打印机可打印一种多功能响应的包埋酵母的水凝胶。聚合物水凝胶对温度和压力的可逆刺激响应可使酵母细胞与水凝胶更易于结合，且印刷聚合物水凝胶的后续光交联可使水凝胶更加坚固。在连续批次发酵过程中，这些酵母负载的活性物质在葡萄糖发酵成乙醇的过程中具有更好的代谢性能，且乙醇的收率维持在90%以上[16]。该细胞固定化平台技术也可适用于其他工业菌株，以实现利用连续生物发酵合成其他高价值的化学品或生物燃料等。

1.2 无机载体材料在生物发酵领域的应用

无机载体材料由无机物单独或混合其他物质制成，如多孔硅、活性炭和氧化铝等（见表3）。材料多为多孔结构，具有较强的吸附能力和静电引力，可将细胞吸附到载体表面，细胞吸附过程反应条件温和、操作简单且载体可反复利用。活性炭因其无毒、吸附性能和力学性能好等优点而被广泛使用[23]。活性炭由于密度较低，在发酵液中具有良好的流动性，能更有效地捕获细胞。以活性炭多孔颗粒载体对丙酮丁酸梭菌（C.acetobutylicum）进行固定化生物发酵为例，细胞浓度、碳源消耗速率、产氢气量和丁醇产量都得到了显著提高[24]。据报道，在C. acetobutylicum固定化发酵过程中，大多数参与编码氢化酶、NADH-铁氧化还原蛋白氧化还原酶和铁氧化还原蛋白的基因（hydGEF、hydA1、hydA2、fhuBDC、CA_P0141-CA_P0142）在基因表达强度上均得到上调[25]。

图2 使用微生物单细胞培养和多细胞共培养负载水凝胶进行生物发酵

表3 利用无机材料固定细胞进行生物发酵

生物炭是生物质在有限氧条件下进行热化学转化而得到的一种具有碳质、多孔和稳定的材料。由于高温热解，生物炭中形成了丰富的独特微孔结构，具有较高的吸附和吸水能力。此外，官能团、矿物质和金属也会引起生物炭碱度的变化，使生物炭具有较强的pH 缓冲能力、阳离子交换能力和电导率[26]。此外，生物炭表面富含官能团和较高的结晶度，这也可帮助促进生物膜的形成和电子转移[27]。生物膜的形成进一步为微生物细胞创造一个内部保护环境，增强细胞对不利环境胁迫的耐受性[28]。例如，利用生物炭固定的C. beijerinckiiF-6对丁醇的耐受性显著提高，且丁醇的生产效率也得到了提高。与游离细胞发酵相比，丁醇和产氢气速率分别达到0.148g/(L·h)和0.299mmol/(L·h)，分别比对照组提高20.23%和48.76%[27]。另一个有趣的现象是生物炭还可以促进细胞之间的电子转移，从而调节厌氧微生物菌群挥发性脂肪酸产物的分布[29]。

1.3 复合载体材料在生物发酵领域的应用

复合载体材料为了改善生物材料的本体或表面性质，由不同材料结合而成（见表4）。复合载体材料有利于材料性能优势互补，具备良好的生物相容性、较高的稳定性和机械强度等优点。聚乙烯醇（PVA）中的羟基和海藻酸盐中的羧基通过酯化反应形成共价键，从而弥补使用单一聚合物固定化载体的缺点，膜的机械强度得到了提高[33]，而且可从两种聚合物中优化提取出最佳的膜。用PVA/海藻酸钙混合物可形成优良的微球，再采用“冻融”技术将鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）固定在微球中进行乳酸生物发酵[34]，乳酸的产量达到理论值的97.6%。与游离细胞相比，还原糖消耗提高了36.9%，乳酸的产量提高了37.1%，达到17.6g/L。从力学性能上看，PVA/海藻酸钙微珠表现出较强的力学特性，固定化细胞有较高的机械稳定性和操作稳定性，成功地应用于连续7个循环的分批发酵，表现出良好的细胞活力和较稳定的乳酸产量[34]。

复合材料作为细胞固定化载体可以制备更大的可控制尺寸。木质纤维素基质可制备成纳米和微米尺度的多孔的纤维素材料，其中微生物细胞可以进入形成的空腔，通过静电和物理吸附固定。为提高乳清发酵生产乳酸的速率，提出了使用各种管状纤维素和管状纤维素/海藻酸盐/聚乳酸复合材料作为实验室固定化载体[35]。聚乳酸的使用是为了降低纤维素中微管的尺寸，其中的复合材料有望提高细胞在凝胶基质中的存活率。例如，以芒果提取的木质纤维素/海藻酸钙/聚乳酸复合材料作为保加利亚乳杆菌（L. bulgaricus）的固定化载体时，可促进乳糖培养基中乳酸发酵，获得更高的乳酸产量和生产强度[35]。与游离细胞相比，乳酸的产量和生产强度分别提高了36.4%和36.5%。

2 高分子膜材料在生物发酵领域的应用

2.1 中空纤维膜

中空纤维膜作为固定化材料，与海藻酸盐等传统有机载体材料相比，具有机械强度和稳定性高的特点。管状中空纤维为细胞封装提供了高的表面积和孔隙率，因此具有更高的底物扩散和传质速率。中空纤维膜等聚合物载体上的细胞固定化还具有其他优点：①较高的细菌密度和生产力；②连续运行，无细胞冲刷问题；③抑菌化合物接触量低；④细胞的长期再生和再利用[38]。基于膜的固定化不需要任何共价交联或离子键，细胞可以简单地在膜壁内外扩散。此外，可以在固定化过程之前制备膜，从而在不影响细胞活力和生产力的前提下，更灵活地设计中空纤维膜的结构。例如，运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）可固定在中空纤维膜生物反应器（immobilized cell hollow fiber membrane bioreactor，ICHFMB）中，从而减轻木质纤维素预处理过程产生的抑制剂在乙醇生物发酵过程中对细胞的毒害作用[39]，并在高抑制剂浓度条件下达到理论乙醇产量的95%。且细胞在膜内的固定也非常稳定，ICHFMB 在相同条件下可实现连续20 次运行。众所周知，木质纤维素水解产物的抑制剂（糠醛、乙酸、5-羟甲基糠醛、香兰素、丁香醛、4-羟基-3-甲氧基肉桂醛等）会对细胞产生毒性作用，而同时暴露在多个抑制剂下对细胞的毒害作用更加明显。与游离细胞发酵相比，固定在中空纤维膜上的细胞因膜屏障作用，即使在水解抑制剂存在情况下，仍能表现出良好的生长和葡萄糖摄取速率[39]。在此发酵过程中，水解抑制剂可从膜孔缓慢的释放，这可使固定化的运动发酵单胞菌逐渐适应水解抑制剂，具有更好的耐受性。ICHFMB在细胞固定化过程中具有很大的灵活性，通过改变水解液流量和膜表面积，可以提高生物发酵的性能。通过将细胞固定在不同的中空纤维膜组件上，可建立细胞与发酵液、细胞与细胞空间上的分离（见图3）。同时浸没式中空纤维膜生物反应器（submerged hollow fiber membrane bioreactor，SHFMB）可改善自由细胞体系木糖消耗速率较低的问题[40]。悬浮的Z.mobilis和木糖发酵菌（Cheffersomyces stipitis）在共培养中因为底物、产物和分解代谢物的抑制作用，在以葡萄糖和木糖混合物作为底物进行发酵中表现出较差的木糖利用。将细胞分别固定在中空纤维膜组件上，使两者达到了空间分离的状态，可显著提高细胞的鲁棒性，有效改善细胞浸没式中空纤维膜（SHFMB）固定细胞的木糖利用效率。与游离细胞共培养相比，在总糖浓度为120g/L 时，木糖消耗量从3%提高到70%，且固定化细胞在连续12批生物发酵后，其发酵性能仍保持稳定[40]。

表4 利用复合材料固定细胞进行生物发酵

浸没式中空纤维膜生物反应器（submerged hollow-fiber membrane bioreactors，s-HF/MBRs）可应用在多细胞体系的生物发酵过程中，克服多细胞培养体系中菌株生长特征不同、产物抑制和底物竞争等问题[41]。该体系中，上游酪丁酸梭菌（C.tyrobutyricum）在A反应器利用蔗糖合成中间体丁酸盐，该中间体随后被蠕动泵运输到B 反应器后被下游巨型球菌（Megasphaera hexanoica）吸收转化为己酸（见图4）。利用s-HF/MBRs 反应器合成己酸的浓度可升高至10.08g/L，生产强度达到0.69g/(L·h)。该研究为首次在浸没式中空纤维膜生物反应器中利用微生物共培养体系发酵合成己酸[41]。

2.2 微米/纳米纤维膜

图3 利用中空纤维膜模块对微生物进行分离和多细胞共培养生物生产

图4 浸没式中空纤维膜装置

近年来，微米/纳米尺度材料吸引了广泛的关注。由于其具有较大的表面积与体积比，可实现细胞的高负载。微米级材料和纳米级材料的精细多孔结构可使底物更易于扩散进入细胞，并且其低扩散阻力使发酵具有更高的反应速率和转化率。此外，与颗粒相比，它们更容易从反应介质中回收，具有良好的连续操作性能。例如，利用聚丙稀微纤维膜作为载体材料固定化琥珀酸放线杆菌（Actinocacillus succinogenes），以葡萄糖为底物发酵产琥珀酸的过程中，琥珀酸的收率和生产强度分别达0.82g/g 和1.04g/(L·h)[42]。同时，采用补料间歇策略可进一步构建实验室规模的微纤维膜生物反应器。为了使细菌能更好地固定在微纤维膜材料上，可对纤维膜进行电晕处理使其膜上带正电，进而可使带负电的细胞通过静电作用更好地固定在聚丙烯微纤维膜上。此外，细胞固定化膜具有良好的再利用稳定性，在发酵多个循环后无活性损失[42]。介孔载体与工业生物技术的相互结合，为工业菌株在生物发酵体系中的可重复利用提供了更广阔的前景。

电纺纳米纤维膜作为组织工程的候选材料，可以模拟天然的细胞外基质（extracellular matrix，ECM），在过去几十年中得到了广泛的研究。电纺纳米纤维膜具有高孔隙率和疏松的三维多孔结构等优点。这种独特的结构可以模拟自然的ECM结构，为细胞固定提供载体[43]。细胞对局部的微米尺度、亚微米尺度和纳米尺度的表面形貌天生敏感[44]，表面形貌的改变会引发不同的细胞行为，包括细胞黏附、细胞定位、细胞运动、调节转录活性和基因表达的细胞内信号通路的改变。因此，电纺纳米纤维膜是一种极好的细胞黏附、增殖和表达基质成分的候选材料。已有研究将电纺醋酸纳米纤维作为L.plantarum生物膜形成的载体材料。纳米纤维膜被证明是细菌生物膜的良好载体，具有很高的稳定性[45]，在整个可重复使用批次中，发酵液中的活细胞约为11 lg(CFU/g)，比标准值高出4 lg(CFU/g)，生物膜与纳米纤维形成一个紧密的结构。与游离细胞发酵相比，生物膜固定化发酵的发酵时间缩短2.8h，21天后植物乳杆菌在发酵乳中的存活率比以浮游细菌高36 倍[45]。微米/纳米纤维膜是生物技术和发酵工程中固定化细菌生物膜的理想载体材料，在微生物学和发酵工程中有着巨大的应用前景。

3 结语与展望

与传统的固定化材料相比，新型高分子多孔膜材料介导的细胞固定化技术在生物发酵领域展示出巨大的应用潜力。近几年，随着聚合物合成技术的发展，越来越多性能优良的新型聚合物载体被开发，进一步促进细胞固定化技术的发展和应用。目前，在生物发酵过程中，应用最广泛的膜生物反应器还局限在实验室规模的应用，不具有广泛的工业化应用能力。新型高分子多孔膜材料介导的细胞固定化技术将极大地提高细胞密度和固定化细胞的性能，在生物技术领域具有广阔的应用前景。近年来，在工业生物技术领域，越来越多的研究报道了利用人工混菌体系合成有用化学品和生物燃料，这也是生物发酵领域中重要的研究方向之一。人工混菌体系可通过劳动分工完成复杂工作，如木质纤维素的直接降解转化、长代谢路径化学品的合成等，且人工混菌体系处在动态平衡的一种状态，这使微生物对复杂环境具有更好的适应性。然而由于不同微生物之间存在底物利用竞争、营养需求条件的不同，如氧气、pH 和水解抑制剂毒害等，人工混菌体系的稳定性和可控性仍存在巨大挑战。通过膜材料介入构建有氧和厌氧的真菌-细菌共培养体系，已经实现直接利用木质纤维素合成乳酸等有用化学品[46]，这也为进一步构建和设计具有可控性和鲁棒性的人工混菌体系提供了借鉴，如可以根据菌体的大小、菌体电荷不同设置梯度膜和不同电荷性质的膜材料，从而设计与构建细菌-酵母或者表面带正电荷-负电荷菌的共生体系，从而进一步提高人工混菌体系的鲁棒性和稳定性。

材料介导细胞固定化技术为工业生物技术领域提供了新的启发。固定化细胞载体材料的性质和固定化过程是生物发酵性能的关键。因此，在选择固定载体材料时需要全方面考虑材料的性能，如力学性能、稳定性和粗糙度等。材料介导的细胞固定化技术已被证明可有效提高固定化细胞在复杂环境的适应性和生长代谢性能。在未来，具有制备工艺简便、稳定性强及可连续操作的细胞固定化技术将在生物发酵领域得到更广泛的应用。