杜亚楠,孟晓慧,梅怡然,谢丹,冉炜,沈其荣

(南京农业大学资源与环境科学学院/江苏省固体有机废弃物资源化研究重点实验室,江苏 南京 210095)

木薯是世界上重要的粮食产物之一,我国木薯年产量达1 000万t以上,年进口木薯(主要是干木薯)200万t以上,在木薯脱皮、生产淀粉和酿酒等加工过程中产生的木薯渣高达数百万吨[1]。木薯渣富含植物养分元素及生长素和赤霉素等植物生长调节剂,具有很大的资源化利用价值[2]。堆肥可消纳大量木薯渣[3]。然而,由于木薯渣含水量高、透气性差,在堆肥过程中分解速率十分缓慢,导致堆肥成本过高。利用木薯渣堆肥进一步生产功能性肥料有望提高木薯渣资源利用效率。

碱解反应是以稀碱溶液为催化剂对生物质进行水解的化学过程,该方法具有操作简单便捷、木质素去除效果显著等优点,广泛应用于含木质素的农业废弃物。该反应能使植物细胞壁中的木质素溶解,腐殖酸水解成小分子有机酸,蛋白质的肽键裂解形成多肽和氨基酸,脂肪皂化为脂肪酸和醇类,细菌细胞壁的磷壁酸和病毒的核酸裂解,并使重金属钝化[4-6]。由于堆肥富含有机质和微生物细胞,利用该方法对堆肥进行水解有望提取出丰富的水溶性小分子有机酸、氨基酸、脂肪酸和养分离子等生物活性物质。目前采用碱解处理的物料多为秸秆类原料,将稀碱处理用于木薯渣等高淀粉类原料的研究较少。有关木薯渣水解液的研究主要集中于制备乙醇[7],尚未发现木薯渣堆肥制备水溶性有机肥的报道。

黄瓜立枯病是由立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)引起的土传性病害,是黄瓜育苗前期死苗倒苗的主要病害。该病原菌侵染力强,寄主范围广,经常造成大面积的缺苗和毁灭性的损失[8]。育苗是现代设施栽培最重要的生产环节之一,在生产上立枯病的防治手段主要依靠化学农药防控,但大量化学农药的使用会造成立枯病菌抗药性[9],其效果受环境条件限制且不稳定,急需新的非化学农药型防治手段。研究表明,施用有机肥能够增强土壤肥力,改善土壤中微生物群落,提高农作物的品质和产量,并且对很多植物病原菌的生长、繁殖均表现出明显的抑制作用[10-11]。黄新琦[12]的研究结果表明,施用生物有机肥对黄瓜土传立枯病有明显的抑制作用。虽然堆肥和堆肥茶在立枯病防控上有一定效果[13],但防效的稳定性也受有机物分解过程和产物组成变化的影响[14]。在“水肥一体化”不断发展的形势下,研究具有溶解快,抑病和促生效果好,可灌施、喷施和蘸根等即用型液体有机肥具有广阔的应用前景。

本研究以木薯渣堆肥为原料,使用KOH溶液进行水解处理,研究不同碱浓度对木薯渣堆肥水解过程的影响,筛选出最优水解浓度,以提高水解液的品质;并通过水培试验外源添加木薯渣堆肥水解液,来验证其对黄瓜立枯病的防病、促生效果,旨在为木薯渣的资源化利用提供新途径,在提升其资源价值的同时,为高效、安全的功能性液体有机肥料的开发和应用提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试植株及肥料黄瓜品种为‘露丰’,购自江苏省农业科学院。木薯渣堆肥采集自江苏佳禾兴农业生物科技有限公司,将所购原料过孔径为380 μm的筛,风干后密封保存备用。其基本性质为:有机质含量467.65 g·kg-1,全氮含量20.34 g·kg-1,全磷含量13.46 g·kg-1,全钾含量4.37 g·kg-1。无菌水解液的制备:用稀硝酸溶液调节木薯渣堆肥水解液pH值至中性,然后用0.22 μm的无菌滤膜过滤除菌。

1.1.2 供试菌株及培养基病原菌为立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani),由笔者所在实验室提供。马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA):马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,自来水1 000 mL,pH自然。马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB):马铃薯200 g,葡萄糖20 g,自来水1 000 mL,pH自然。立枯丝核菌菌悬液的制备:在PDA培养基上培养立枯丝核菌3 d后,将其转接到PDB液体培养基中,在28 ℃ 、170 r·min-1条件下继续培养3 d,用双层纱布滤出菌丝团,将菌丝搅碎,用无菌水将菌悬液调制到透光率为1.80%。

1.2 试验设计

1.2.1 木薯渣堆肥水解试验总反应体系为150 mL,将木薯渣堆肥与KOH溶液按照质量体积比为 1∶7 混合,置于250 mL三角瓶中,由封口膜密封后,放入90 ℃恒温水浴锅中加热反应1 h。共设4个处理:不加碱处理及0.5、1.0、2.0 mol·L-1KOH处理,每个处理3个重复。水解结束后,将水解产物5 000 r·min-1离心10 min,上清液装入50 mL离心管-20 ℃保存,用于全氮、全磷、全钾、水溶性有机碳以及腐植酸含量的测定;残留物用自来水冲洗至中性,在恒温鼓风干燥箱60 ℃烘干,用于固体分解率、木质纤维素含量的测定以及扫描电镜(SEM)、傅里叶红外光谱(FTIR)分析。综合以上各项指标确定最优水解液。

1.2.2 木薯渣堆肥水解液对立枯丝核菌菌丝生长的抑制作用采用菌丝生长速率法初步检测最优水解液对黄瓜立枯病病原菌菌丝生长的抑制作用。共设4种稀释倍数,分别将木薯渣堆肥无菌处理液稀释80、40、20和10倍,用只有PDA培养基的处理作为空白对照(CK)。不同处理分别接种黄瓜立枯病菌菌饼(直径7 mm),菌丝面朝上,置于28 ℃恒温培养箱培养。当对照组病原菌菌丝长满整个培养平板时试验即停止,测量不同处理下病原菌的菌落直径,每个处理4个重复。

1.2.3 木薯渣堆肥水解液对水培黄瓜苗期的防病与促生效果挑选籽粒饱满的黄瓜种子进行浸种催芽,待黄瓜出现2片子叶后移入含1/4 MS营养液的三角瓶中继续培养。挑选长势一致的15 d苗龄的黄瓜幼苗,移入装有50 mL不同处理的营养液中,每个处理加入3 mL立枯丝核菌菌悬液,观察发病周期。共设 6个处理:CK为1/4 MS营养液处理;T1—T5分别为木薯渣堆肥水解液稀释10、20、40、80和120倍处理。每个处理6个重复。温室条件下,每隔1～2 d加1次营养液,培养至对照组黄瓜幼苗发病死亡。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 堆肥的固体分解率通过测定木薯渣堆肥的固体分解率,判断水解效果。固体分解率(x)的计算公式为:x=(m1-m2)/m1×100%。式中:m1为加入木薯渣堆肥的质量;m2为水解物离心后剩余残渣的质量。

1.3.2 水解残渣中木质纤维素含量72%浓硫酸法测定木质素含量;差重法测定纤维素含量;2.0 mol·L-1盐酸水解法测定半纤维素含量。

1.3.3 水解残渣的扫描电镜(SEM)观察将水解残渣烘干样品置于电镜载物台导电胶上,并用洗耳球吹掉表面脏物,经低温真空干燥并离子溅射镀金后,利用Gemini SEM 300场发射电子显微镜(Carl Zeizz Microscopy GmbH)观察其表面特征。

1.3.4 水解残渣傅里叶红外光谱(FTIR)分析将水解残渣烘干样品粉末与KBr(光谱纯)按体积比为 1∶100 的比例混合于玛瑙研钵中研磨均匀;将混合物置于真空红外干燥器内干燥3 min,使用压片机压成薄圆片;用傅里叶红外光谱仪(Thermo Nicolet iS10)进行扫描测定,波数范围400～4 000 cm-1,扫描间隔 2 mm,扫描次数128次,分辨率4 cm-1,以KBr为空白对照,采集背景值。

1.3.5 水解液的基本理化性质全氮、全磷和全钾含量测定参照农业行业标准(NY 525—2012)和文献[15]中有关有机肥料养分测定的方法,先将木薯渣堆肥水解液充分混匀,取1 mL木薯渣堆肥水解液,浓硫酸-双氧水消煮,定容到100 mL待测。采用连续流动自动分析仪(Auto Analyzers 3,Bran+Luebbe Germany)测定全氮含量;用钼锑抗比色法722分光光度计测定全磷含量;用FP640火焰光度计测定全钾含量,每个样品重复3次。混匀后的木薯渣堆肥水解液经0.45 μm微孔滤膜过滤,滤液稀释一定浓度,用TOC仪(TOC-LCPN,岛津)测定水溶性有机碳含量,每个样品重复3次。参照农业行业标准(NYT 1971—2010)中有关水溶肥料腐植酸含量的测定方法测定腐植酸含量,每个样品重复3次。

1.3.6 菌落直径采用十字交叉法测量,并计算抑制率。菌落扩展直径(mm)=菌落平均直径(mm)-菌饼直径(7 mm)。菌丝生长抑制率=(对照菌落扩展直径-处理菌落扩展直径)/对照菌落扩展直径×100%。

1.3.7 植株生长指标收获并记录各处理组黄瓜的株高、茎粗、叶面积、叶绿素相对含量、地上部鲜重以及根系鲜重等指标。用SPAD-502 chlorophyll meter(Minolta,Japan)测定叶绿素含量,选用根系扫描仪(Epson perfection V700 Photo,SEIKO EPSON corp)拍摄根系照片。

1.4 数据处理与分析

采用Excel 2010统计软件进行数据处理,采用SPSS Statistics 22软件中的Duncan’s法和LSD法进行差异显著性分析,用Origin 9.0软件对获得的数据绘制图表。

2 结果与分析

2.1 KOH溶液水解木薯渣堆肥性质及表征分析

2.1.1 木薯渣堆肥固体分解率如图1所示:与不加碱处理相比,不同浓度KOH溶液处理后的木薯渣堆肥固体分解率均显著增加(P<0.05)。当KOH浓度为1.0 mol·L-1时,固体分解率最高,为22.56%,与不加碱处理相比,增加123.37%。当KOH浓度为2.0 mol·L-1时,木薯渣堆肥的固体分解率与1.0 mol·L-1KOH处理无显著差异(P>0.05)。这表明最适合木薯渣堆肥固体分解的KOH浓度是1.0 mol·L-1。

图1 不同浓度KOH溶液对木薯渣堆肥固体 分解率的影响Fig.1 Effects of KOH solution of different concentrations on solid decomposition rate of cassava dreg compost 不同字母表示处理间在0.05水平差异显著。下同。The different letters indicate significant difference at 0.05 level in different treatments. The same as follows.

2.1.2 木薯渣堆肥水解残渣中木质纤维素含量从图2可知:在未加碱处理条件下,水解残渣中木质素含量最高,纤维素次之,半纤维素含量最低。加碱之后木质素及半纤维素被脱除,纤维素含量显著增加(P<0.05),并且当KOH溶液的浓度由0.5 mol·L-1增加至2.0 mol·L-1,木质素、半纤维素含量逐渐减少,纤维素含量逐渐增加。当KOH浓度为1.0 mol·L-1时,纤维素含量最高为26.01%,与不加碱处理相比,增加30.68%;木质素含量为10.64%,与不加碱处理相比,减少52.09%;半纤维素含量为3.14%,与不加碱处理相比,减少24.15%。当KOH浓度升至2.0 mol·L-1时,木质素、半纤维素含量降幅微弱,几乎不变。由此可见,在1.0 mol·L-1KOH溶液处理条件下,既能高效脱除木质素和半纤维素,又能最大程度保留纤维素。

图2 不同浓度KOH溶液处理后木薯渣堆肥 水解残渣的木质纤维素含量Fig.2 The lignocellulose contents of residues from cassava dreg compost treated with KOH solution at different concentrations 不同字母表示同一指标处理间在0.05水平差异显著。The different letters indicate significant difference of the same item at 0.05 level in different treatments.

2.1.3 木薯渣堆肥水解残渣的扫描电镜观察从图3可知:在不加碱处理条件下,木薯渣堆肥大颗粒团聚在一起,表面相对完整紧凑;经KOH溶液处理过后,样品被破碎成块状,表面粗糙,结构疏松,木质纤维素的结构被显著破坏。当KOH溶液浓度由0.5 mol·L-1增加至2.0 mol·L-1,破坏效果愈发明显,当KOH浓度为2.0 mol·L-1时,相对于1.0 mol·L-1处理下的木薯渣堆肥,表面结构破坏程度变化不大。

图3 不同浓度KOH溶液处理木薯渣堆肥水解残渣的扫描电镜图像Fig.3 Scanning electron microscopy(SEM)images of residues from cassava dreg compost treated with KOH solution at different concentrations

图4 不同浓度KOH溶液处理木薯渣堆肥水解残渣的傅里叶红外分析Fig.4 Fourier transform infrared spectroscopy(FTIR)analysis results of residues from cassava dreg compost treated with KOH solution at different concentrations

2.2 木薯渣堆肥水解液对黄瓜立枯病的防治促生效果

2.2.1 木薯渣堆肥水解液基本理化性质从表1可知:与不加碱处理相比,加碱能够显著促进木薯渣堆肥中全氮、全磷的溶出(P<0.05)。当KOH溶液浓度为2.0 mol·L-1时,木薯渣堆肥水解液中的全氮、全磷含量均达到最高值,但与1.0 mol·L-1KOH溶液处理相比,木薯渣堆肥水解液中的全氮、全磷含量增幅微弱,仅为0.43%和6.52%(P<0.05)。与上述物质含量变化不同,木薯渣堆肥水解液中的水溶性有机碳和腐植酸含量虽然在加碱之后显著增加(P<0.05),但是经2.0 mol·L-1KOH溶液处理的木薯渣堆肥水解液中水溶性有机碳和腐植酸含量反而低于1.0 mol·L-1KOH溶液处理。因此,1.0 mol·L-1KOH溶液处理木薯渣堆肥有机养分溶出效果最好。

表1 不同浓度KOH溶液处理木薯渣堆肥的水解液基本理化性质Table 1 The basic physic-chemical characteristics of cassava dreg compost hydrolysate

虽然碱浓度的增加在一定范围内可以促进木薯渣堆肥固体物质的溶解、有机养分的溶出,以及木质素、半纤维的降解,但是在实际生产应用中,还得考虑资源耗费和后期处理工作繁杂程度,所以最终选择的KOH溶液浓度为1.0 mol·L-1。

2.2.2 木薯渣堆肥水解液对立枯丝核菌菌丝生长的抑制作用从图5可知:菌丝在含有过滤除菌的木薯渣堆肥水解液培养平板上的生长速度显著低于对照处理,且随着木薯渣堆肥水解液稀释倍数的降低,抑制作用逐渐增强。在稀释80、40、20和10倍的培养基上,立枯丝核菌的菌丝直径分别为62.20、59.90、53.80和40.20 mm;菌丝生长抑制率分别为18.80%、21.80%、29.77%和47.52%。由此可见,木薯渣堆肥水解液能够有效抑制立枯丝核菌的生长。

图5 木薯渣堆肥水解液对立枯丝核菌菌丝生长的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of cassava dreg compost hydrolysate on mycelial growth of Rhizoctonia solaniCK为不添加水解液的空白对照。CK indicates blank control that treated without adding hydrolysate.

2.2.3 木薯渣堆肥水解液对水培黄瓜苗期的防病与促生效果图6为15 d苗龄的黄瓜幼苗接种立枯丝核菌3、6和10 d的发病情况。对照组黄瓜幼苗在接种病原菌6 d后,茎基部产生暗褐色病斑,病部出现凹陷,叶片出现卷曲发黄的症状。随着时间的推移,叶片黄色部位逐渐从叶边缘向叶中心扩展,待接种病原菌10 d后,叶片卷曲萎蔫症状非常明显,甚至死亡。然而,在稀释后的木薯渣堆肥水解液中培养的黄瓜幼苗并未出现典型发病症状,表明木薯渣堆肥水解液能有效防治黄瓜立枯病。

图6 木薯渣堆肥水解液对水培黄瓜的防病促生作用Fig.6 The effect of cassava dreg compost hydrolysate on disease control and growth promotion of cucumber by solution culture experiment CK为1/4 MS营养液培养(空白对照);T1—T5分别为黄瓜幼苗的木薯渣堆肥水解液分别稀释10、20、40、80和120倍处理。下同。CK is 1/4 MS nutrient solution culture(blank control);T1-T5 indicate the cassava dreg compost hydrolysates used to treat cucumber seedlings were diluted to 10,20,40,80 and 120 times. The same as follows.

外源添加木薯渣堆肥水解液培养的苗期黄瓜生长情况见表2。对照组植株在立枯丝核菌的胁迫下,生长发育受阻,株型较小,叶片发黄萎蔫。在木薯渣堆肥水解液中培养的植株,其生长状况则显著优于对照组。T2处理的促生作用最优,其株高、茎粗、叶绿素相对含量、叶面积、地上部鲜重和根鲜重分别比对照组增加了181.79%、49.64%、166.74%、46.85%、227.14%和180.72%。结果表明,在黄瓜水培体系中外源添加不同稀释倍数的木薯渣堆肥水解液均能不同程度地促进黄瓜幼苗的生长。

表2 木薯渣堆肥水解液对水培黄瓜苗期的促生作用Table 2 Growth promoting effect of cassava dreg compost hydrolysate on the seedling stage of

图7表明:高浓度的木薯渣堆肥水解液会抑制黄瓜根系生长,T1处理黄瓜幼苗总根长、根面积比对照下降,而其他处理能明显促进黄瓜的根系发育,且随稀释倍数的增加,促生效果逐渐减弱。与CK相比,T2处理的总根长、根面积分别增加122.66%和204.08%;T3处理分别增加93.73%和141.93%;T4处理分别增加60.92%和95.26%;T5处理分别增加49.69%和85.23%。上述结果均表明,在适宜浓度下,木薯渣堆肥水解液能够促进黄瓜幼苗根系生长。

图7 木薯渣堆肥水解液对水培黄瓜苗期根系生长的影响Fig.7 The effect of cassava dreg compost hydrolysate on root growth of cucumber seedling by solution culture experiment

3 讨论

本研究采用KOH溶液水解木薯渣堆肥,能够将堆肥中不溶性大分子物质转化为可溶性物质,其水解液富含有机养分,可作为有机液肥使用;经过脱除木质素后的堆肥残渣富含多孔纤维素,也具有潜在的应用价值[16]。与高温高压水解过程相比,本研究在常压、90 ℃、1.0 mol·L-1KOH和1 h停留时间条件下进行堆肥水解试验,属于一种较低成本的温和处理方法[17]。

本研究在对木薯渣堆肥进行碱解的过程中发现,在一定范围内碱浓度越高,固体分解率越大,这与众多学者的研究结果一致[18-19],但是当碱浓度超过1.0 mol·L-1后,反而不利于反应的进行,可能是因为过量的碱液使少量的木质纤维素发生碳化,使干物质被溶出[20]。稀碱溶液处理木薯渣堆肥时,其木质纤维素组成比例发生很大变化,碱浓度越大,对半纤维素和木质素的降解效果越好。这可能与碱液中的OH-数量有关,当碱浓度增加时,OH-数量增加。碱性条件下,OH-能够破坏木质素分子间的醚键,削弱半纤维素和纤维素间的氢键,皂化半纤维素和木质素之间的酯键,进而使部分木质素与纤维素分解生成酚类和酸类物质[21]。本研究中的扫描电镜(SEM)图像验证了稀碱水解可以促进木质纤维素的降解。红外光谱吸收峰相对强度的改变也说明碱处理使木薯渣堆肥中的碳水化合物、蛋白质、木质素、半纤维素等物质大量降解溶出[22-23],堆肥水解液中水溶性有机物和养分含量丰富,可作为有机液肥使用。

由堆肥制备的液体有机肥能有效抑制某些叶传和土传病害,但具体以何种物质或通过何种方式起到关键作用,目前尚无统一定论。丁驰等[24]研究未经碱预处理与经过2% NaOH碱预处理的水稻秸秆水解液中抑制物组成成分,发现经过碱处理的水稻秸秆水解液中抑制物明显增加,尤其是酚类和酸类物质,其种类和含量较对照组显著增加。提取液中的有机酸类、酚类、挥发性脂肪酸以及氨等化合物可以通过改善植物营养生长状况、对病原菌有直接毒性或诱导植物系统抗性以抵御病原菌侵染[25-27]。McQuilken等[28]经过试验研究发现,堆肥提取液经过滤除菌后仍保持一定的抑菌效果,可能是堆肥提取液中微生物产生的副产物或者代谢产物在起作用。在本研究中,由木薯渣堆肥制成的有机液肥经过滤除菌后能显著降低立枯丝核菌菌丝生长速度,其抑制率高达47.52%,由此可以推断出该堆肥水解液中可能含有某些抑制立枯丝核菌生长的物质。

木薯渣堆肥水解液中氮、磷、钾及有机质含量丰富,在防病促生方面有非常显著的效果。本研究通过水培方式观察木薯渣堆肥水解液对黄瓜立枯病的防治效果后发现,外源添加一定浓度的木薯渣堆肥水解液能够显著促进黄瓜幼苗的生长,增加作物的干、鲜重,并且有效抑制黄瓜立枯病的发生。这可能是因为木薯渣堆肥水解液富含的水溶性有机物,尤其是有机酸类和酚类化合物以及多种营养元素可以为作物提供足够的养分从而促进作物生长,增加产量,还可能直接或经化学修饰后诱导黄瓜幼苗产生抗性[29-30]。本研究采用水培的方式来验证木薯渣堆肥水解液对黄瓜立枯病的防治效果,是因为水培的方式易于控制植株的生长条件,可更直观地观察植株的发病情况,但是考虑到实际生产应用中田间植株生长环境复杂多变,在实际应用堆肥水解液来防治植物病害时,应充分考虑堆肥来源的复杂性和病原菌种类的多样性,后续需要对提取液中的抑菌功能物质成分进行提取和鉴定,使得对于农作物病害的绿色防控更具有可预见性和针对性,后续还需结合盆栽及大田试验进行验证。

综上所述,KOH溶液处理能显著提高木薯渣堆肥的水解效率,且在KOH溶液浓度为1.0 mol·L-1时,水解效果最好;该水解液能显著抑制立枯丝核菌菌丝的生长,有效防治黄瓜立枯病,促进黄瓜生长。