高安平，龚爱华

（江苏省太仓市疾病预防控制中心，江苏 太仓 215400）

0 引言

纳豆通常以黄豆为原料，经枯草芽孢杆菌在适宜条件下发酵制成的豆制品，其有效成分纳豆激酶（Nattokinase，简称NK），是在发酵过程中由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）产生的丝氨酸蛋白酶，能特异性水解纤维蛋白，从而溶解血栓[1]。

目前，纳豆激酶主要使用黄豆作为氮源来生产，但黄豆培养基发酵产物中嘌呤含量高，限制了痛风患者的使用。为此，本研究以红芸豆为培养基氮源，使用代谢组学方法，比较分析红芸豆培养基与黄豆培养基经枯草芽孢杆菌发酵后代谢产物的差异。

1 材料与方法

1.1 菌种与材料。菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为江苏大学医学院肿瘤转化医学实验室分离，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14434；材料：红芸豆及黄豆，市售；纤维蛋白原、凝血酶（2000 U/mg）购于沈阳拜英生物技术有限公司；尿激酶标准品（1240IU/瓶）购于中国食品药品检定研究院；氯化钠、磷酸二氢钾、NaOH等试剂为分析纯；乙腈、异丙醇、甲酸为色谱纯。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配制：LB液体培养基：蛋白胨1%，氯化钠0.5%，酵母粉1%，PH 7.0。LB固体培养基：蛋白胨1%，氯化钠0.5%，酵母粉1%，琼脂粉2%，PH 7.0。红芸豆发酵培养基：红芸豆粉2%，葡萄糖4%，氯化钠1.5%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，pH值为7.0，均为w/v。黄豆发酵培养基：黄豆粉2%，葡萄糖4%，氯化钠1.5%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，pH值为7.0，均为w/v。以上培养基均经121℃高压灭菌20 min。

1.2.2 种子液制备：菌种活化：取30μL保存于-80℃的甘油菌接种于3 mL LB液体培养基，37℃，225rpm，培养6 h。四区划线接种LB固体培养基，37℃培养15h，挑取单菌落，接种3 mL LB液体培养基，37℃，225rpm培养6 h，得菌种子液。……