王若男，吴赟*，张广献

科学研究

芋螺毒素Lt14a的质量控制研究

王若男1，吴赟1*，张广献2

（1. 广东医科大学 科研平台服务管理中心 广东省医学分子诊断重点实验室，广东 东莞 523808；2. 广州中医药大学 基础医学院，广东 广州 510006）

目的 建立芋螺毒素Lt14a原料药的质量控制方法。方法 采用高效液相色谱法检测芋螺毒素Lt14a的含量和有关物质。结果 研究了芋螺毒素Lt14a的多项质量指标，初步建立了质量控制方法，包括性状、溶解性、水分、pH值、比旋度、折光率、有关物质和含量测定。结论 所建立的芋螺毒素Lt14a的质量控制方法重复性好，结果准确、可靠。

多肽；芋螺毒素；质量控制

芋螺是一类生活在海洋中的软体动物，在大部分的热带和亚热带海域都有分布[1-2]。芋螺通过其毒管组织产生芋螺毒素，用于捕获猎物或防御天敌。芋螺毒素是一类通常包括12～50个氨基酸残基和1～5对二硫键的多肽[3-4]，它的功能极其多样，可以选择性地作用于各种亚型的离子通道或神经递质受体，被认为是神经科学研究的重要分子工具和临床治疗药物的重要先导化合物来源[5-6]。芋螺毒素Lt14a（MCPLCKPSCTNC）中含有13个氨基酸残基和2对二硫键，最早在信号芋螺的毒管cDNA文库被发现[7]。在此前的研究中，Lt14a表现出了良好的镇痛活性，较低的急性、细胞和遗传毒性[8-9]；靶向作用于神经元烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs），且不会导致药物依赖[10]。作为一种潜在的镇痛化合物，目前Lt14a已经进入了临床前研究阶段。为了能够进一步的评价Lt14a的药物性能，本文对芋螺毒素Lt14a原料药的质量控制方法进行了研究[11-12]。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

高效液相色谱仪（Agilent 1200，美国安捷伦）；恒温恒湿箱(上海一恒)；紫外可见分光光度计（UV-1102，上海天美）；自动旋光仪（WZZ-2S，上海精科）；电子天平（CP225D，德国Sartorious）；pH计（PB-10，德国Sartorious）；阿贝折射仪（ZWAJ，上海上光）；卡尔费休水分仪（梅特勒-托利多）；超纯水机（PURELAB Classic，英国ELGA）。芋螺毒素Lt14a样品（批号20190301、20190302、20190303、20190304），三氟乙酸（Sigma，色谱纯）；乙腈（Sigma，色谱纯），冰醋酸（分析纯），二甲基甲酰胺（分析纯），二氯甲烷（分析纯）。

1.2 理化性质检测

1.2.1 外观

取芋螺毒素Lt14a样品置于光线明亮处通过肉眼观察其颜色与状态。

1.2.2 溶解性

称取0.01 g Lt14a样品分别溶解于去离子水、乙腈、1%醋酸溶液、二甲基甲酰胺、二氯甲烷中，观察并记录其溶解性。

1.2.3 水分

称取0.1 g Lt14a样品，置卡尔费休水分仪中测定样品水分。

1.2.4 pH值

称取Lt14a样品，加去离子水溶解，配制成0.1 mg·mL-1的溶液，测定溶液的pH值。

1.2.5 旋光度

称取Lt14a样品，加去离子水溶解，配制成浓度为2.0 mg·mL-1的溶液，置于自动旋光仪中测定比旋度（以无水物计）。

1.2.6 折光率

称取Lt14a样品，加去离子水溶解，配制成浓度为1.0 mg·mL-1的溶液，在室温条件下，置于阿贝折射仪中测定折光率。

1.3 有关物质检测

称取Lt14a样品，配置成浓度为5 μg·mL-1的溶液。取20 µL样品溶液进样高效液相色谱仪，记录色谱图。采用面积归一化法计算，分别计算各批次样液单一杂质峰和各杂质的峰面积总和（除去溶剂峰）。

1.4 含量检测

1.4.1 溶液配制

将批号20190301的Lt14a样品设置为对照品，配制成质量浓度为5 mg·mL-1的对照品溶液。再分别称取批号20190302、20190303、20190304的Lt14a样品，配制成质量浓度为0.5 mg·mL-1的样品溶液。

1.4.2 线性范围的确定

取Lt14a对照品溶液，加去离子水配制成质量浓度依次为0.048、0.201、0.402、0.804、1.005、1.508和2.01 mg·mL-1的标准系列溶液，分别取20 µL样品溶液进样高效液相色谱仪，记录色谱图。以样品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制线性关系图。

1.4.3 重复性检测

取Lt14a对照品溶液，加去离子水稀释至质量浓度为0.5 mg·mL-1，进样高效液相色谱仪，检测5次，计算峰面积的平均值及RSD值。

1.4.4 含量检测

以批号20190301的Lt14a样品为对照品，通过高效液相色谱仪测定其他3批样品（20190302、20190303、20190304）中的Lt14a含量。

2 结果与讨论

2.1 理化性质

2.1.1 外观

于光线明亮处通过肉眼观察4个批次的Lt14a样品，均为白色结晶性粉末，无臭无味。

2.1.2 溶解性

分别检查Lt14a样品在去离子水、乙腈、1%醋酸溶液、二甲基甲酰胺、二氯甲烷中的溶解性。具体结果见表1。在室温条件下，Lt14a在水和1%醋酸溶液中易溶，在二甲基甲酰胺中溶解，在乙腈和二氯甲烷中不溶。

表1 芋螺毒素Lt14a在不同溶剂中的溶解性

2.1.3 水分

4个批次的Lt14a样品的水分检测结果见表2。各批次之间水分含量均匀且均不大于8%。

表2 4个批次Lt14a样品的水分检测结果

2.1.4 pH值

4个批次的Lt14a样品的pH值检测结果见表3。4个批次的Lt14a样品水溶液的pH值都在3.4～3.5之间，呈弱酸性。

表3 4个批次Lt14a样品的pH值检测结果

2.1.5 旋光度

4个批次的Lt14a样品的旋光度检测结果见表4。由结果可知，Lt14a的平均旋光度为-26.4，为左旋性药物。

表4 4个批次的Lt14a样品的旋光度检测结果

2.1.6 折光率

4个批次的Lt14a样品的折光率检测结果见表5。Lt14a的平均折光率为1.333。

表5 4个批次的Lt14a样品的折光率检测结果

2.2 有关物质检测

通过高效液相色谱法分别记录了4个批次的Lt14a样品的色谱图，采用面积归一化法计算得到了每批次样品中的总杂质和最大单一杂志的百分率。由表6中的结果可见，Lt14a样品的总杂质含量都小于2%，最大单一杂质含量都小于1%。

表6 4个批次的Lt14a样品的有关物质检测结果

2.3 含量检测

2.3.1 线性范围的确定

根据1.4.2的方法，以样品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制的含量检测线性关系图如下图1。最终获得的线性方程为：=100 20.49+83.15，相关系数=0.999 82 (=7)。结果表明，Lt14a在0.048～2.01 mg·mL-1范围内线性关系良好。

2.3.2 重复性试验

根据1.4.3的方法，检测质量浓度为0.5 mg·mL-1的Lt14a对照品的高效液相色谱重复性。5次检测的峰面积值分别为5 124.7、5 089.6、5 133.1、5 104.5、5 176.0，峰面积平均值为5 131.4，RSD为0.87%。重复性非常好。

2.3.3 含量检测

根据以上的结果，以批号20190301的Lt14a样品为对照品，通过高效液相色谱法检测其他3批样品（20190302、20190303、20190304）中的Lt14a含量，检测结果见表7。从结果中可见，3批样品中Lt14a质量分数均大于98%，符合原料药含量的相关规定。

3 结 论

本研究根据国家法规对原料药的相关要求，研究了芋螺毒素Lt14a的多项质量指标，初步建立了质量控制方法，包括性状、溶解性、水分、pH值、比旋度、折光率、有关物质和含量测定，可以很好地控制芋螺毒素Lt14a的产品质量，样品检测结果均在期待的限度内，表明芋螺毒素Lt14a的质量可控。

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Study on the Quality Control of Conotoxin Lt14a

1,1,*,2

（1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Medical Molecular Diagnostics, Scientific Research Platform Service Management Center, Guangdong Medical University, Dongguan Guangdong 523808, China; 2. School of Fundamental Medical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou Guangdong 510006, China）

In order to establish the quality control method of conotoxin Lt14a, the content and related substances in Lt14a were determined by high performance liquid chromatography (HPLC). Several quality indexes of Lt14a were studied, and the quality control method was established, including character, solubility, moisture, pH value, specific rotation, refractive index, related substances and content. The results showed that the established quality control method of Lt14a had good repeatability, and results were accurate and reliable.

Oligopeptide; Conotoxin; Quality control

广东省基础与应用基础研究基金联合基金项目（项目编号：2020A1515111040）；广东医科大学科研基金自然科学类面上培育项目（项目编号：GDMUM2020016）。

2021-04-09

王若男（1991-），女，山西运城人，助理实验师，硕士研究生，研究方向：食品科学和生物化学。

吴赟（1987-），男，助理研究员，博士研究生，研究方向：蛋白质与多肽生物化学。

TQ464.7

A

1004-0935（2021）06-0757-03