赵梓桐，李景恩，张清峰，赵 猛，韩 艺，何 静，张 阳，王文君

（江西农业大学 食品科学与工程学院，江西 南昌 330045）

【研究意义】柳叶腊梅是我国特有的腊梅属植物中的一个种，半常绿灌木[1]，主要分布于我国的江西省、浙江省、湖南省、安徽省、福建省，在一些地区又被称为黄金茶、食凉茶等[2-4]。柳叶腊梅包含多种生物活性成分，根据古籍记载，柳叶腊梅有清热解毒、健胃消食、祛风解表、芳香化湿之效[5]。近些年的研究表明，柳叶腊梅具有抗氧化[6]、降血脂[7]、降血糖[8]、保肝[9]、抑菌[10]等作用。黄酮类化合物作为柳叶腊梅中重要的生物活性物质之一，被认为是促进人体健康的化学成分，但是关于柳叶腊梅叶中黄酮类化合物的报道较少。分析柳叶腊梅叶总黄酮中单体成分，确定出主要抗氧化活性物质，为柳叶腊梅的开发提供理论依据。【前人研究进展】黄酮类化合物几乎存在于每种植物所有部位中，通常情况下，植物的花、果、叶中含量较高，并且常以游离态（苷元）或与糖结合成苷（包括O-糖苷或C-糖苷两种苷类）或者与鞣酸结合成酯的形式存在。现在的黄酮类化合物是泛指具有C6-C3-C6结构的一类化合物。黄酮类化合物具有多种活性功能，Cheng等[11]研究结果表明黄酮类化合物具有良好的抗氧化和抑菌作用；Huang等[12]通过细胞实验，表明黄酮类化合物可以有效抑制癌细胞的迁移和入侵；Chen 等[8]通过山腊梅乙醇提取物对糖尿病模型小鼠的研究，结果显示山腊梅乙醇提取物显著改善了糖尿病小鼠的脂代谢相关指标和糖耐量异常；黄酮类化合物对非酒精性脂肪肝的预防和改善同样具有良好的作用[13]。【本研究切入点】柳叶腊梅叶中富含黄酮类化合物，但其具体黄酮单体物质及单体物质所占含量还有待分析，清除自由基的主要活性成分也有待确定。【拟解决的关键问题】本文利用LC-MS 和HPLC 两种方法鉴定出柳叶腊梅叶乙醇提取物中含有的主要成分及含量。对柳叶腊梅叶乙醇提取物的体外抗氧化活性进行测定，并且确定出清除自由基的主要活性成分。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：柳叶腊梅叶，购于浙江丽水经销商。

试剂：甲醇和乙腈（HPLC 级，美国TEDIA 公司），芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、木犀草素-5-O-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素、山奈酚标准品（＞98%，HPLC 级，北京Solarbia 科技有限公司），阿福豆苷（＞98%，HPLC 级，上海源叶生物科技有限公司）,其他化学试剂（分析纯，当地化学试剂供应商）。

1.2 仪器与设备

FBL-100 型高速粉碎机（上海菲力博食品机械有限公司），HF-20B 型超声循环提取机（北京宏祥隆生物科技公司），RE-52AA 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），HH-6数显恒温水浴锅（国华电器有限公司），Scientz-10N 冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司），M2 型酶标仪（美国Molecular Device 公司），Agilent 1260 Infinity液相色谱仪（安捷伦科技公司），AB SCIEX Triple TOF 5600+（美国SCIEX公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 柳叶腊梅叶乙醇粗提物制备 柳叶腊梅叶经打粉机粉碎后过60目筛，称取1 kg粉末，在体积分数为60%的乙醇中浸泡过夜。次日，参照陈慧[14]的研究稍作修改，以超声时间60 min，超声功率为1 500 W，料液比为1∶20（g/mL）及超声温度60 ℃的条件对柳叶腊梅粗黄酮进行提取，收集滤液，将滤渣按照上述条件再次提取，合并两次滤液。将合并后的滤液抽滤后，减压浓缩得到柳叶腊梅粗黄酮浓缩液，冷冻干燥后，干燥器中保存。

1.3.2 柳叶腊梅乙醇粗提物的分离纯化 将聚酰胺树脂按照陈慧[14]进行装柱活化，将1.3.1 中收集到的粗黄酮粉末用蒸馏水复溶，从装好聚酰胺树脂的层析柱上端缓缓加入，待样品吸附至饱和，先用水洗脱和30%乙醇洗脱，再用60%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱的洗脱液（即为柳叶腊梅叶总黄酮），55 ℃减压浓缩，冷冻干燥，干燥器中保存备用。

1.3.3 柳叶腊梅叶总黄酮含量的测定（1）标准曲线的制作。根据参考文献[14]稍作修改，用60%乙醇水溶液配制浓度为1 mg/mL 的芦丁标准品溶液。精确吸取0.1，0.5，1，1.5，2，2.5，3 mL的标准溶液，分别置于25 mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，静置6 min，再加10%硝酸铝溶液0.3 mL，静置6 min，最后加4%氢氧化钠溶液4 mL，用60%乙醇定容至刻度，摇匀，静置15 min，取200 μL，用酶标仪在510 nm 测吸光度。根据实验数据，可得回归方程：Y=6.222 5X-0.035 4，R2=0.996 3，标准曲线的线性范围为0.004～0.120 mg/mL。以芦丁的标准溶液的浓度为横坐标，以测得相应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线（图1）。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

（2）柳叶腊梅叶总黄酮含量的测定。60%乙醇溶解样品，按照芦丁标准曲线的显色方法显色，测定吸光度，计算柳叶腊梅总黄酮的含量，公式如下：

式中，W为总黄酮的百分含量；c为总黄酮的浓度；m为样品质量。

1.3.4 LC-MS 分析 样品处理：用水将样品稀释至适当浓度，13 000 r/min 高速离心10 min，取0.5 mL 上清液移至1.5 mL自动进样瓶，备用。

HPLC 条件：C18 色谱柱（75 mm×2.1 mm×2 μm）；流速：0.2 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：1 μL；流动相：0.2%甲酸水（A）-乙腈（B）系统；梯度洗脱条件：0～15 min，5～40% A；15～30 min，40～95% A；30～32 min，95～95%A；32～35 min，95～5%A；检测波长：DAD全波长扫描190～400 nm。

LC-MS条件：负离子模式；ESI源；CUR：400.000 psi；GS1：50.000 psi；GS2：50.000 psi；ISVF：4 500.000 V；TEM：500 ℃。

1.3.5 HPLC 分析 甲醇溶解样品，经0.22 μm 的有机滤膜过滤，备用。色谱条件：C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）；流速：1 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：10 μL；流动相：乙腈（A）-0.1%乙酸超纯水（B）系统；梯度洗脱条件：0～15 min，10～25%A；15～30 min，25～40%A；30～40 min，40～50%A；检测波长：254 nm。

1.3.6 柳叶腊梅叶总黄酮体外抗氧化能力检测

1.3.6.1 DPPH· 用无水乙醇配制0.3 mmol/L DPPH·溶液，柳叶腊梅总黄酮配制成不同浓度（20，40，60，80，100，120 μg/mL）。以96 孔板为反应载体，517 nm 测定吸光度，具体实验操作参照实验体系表（表1）进行，各组实验均重复测定3次，Vc做阳性对照，根据公式计算自由基清除率。

表1 体外DPPH·清除试验体系表Tab.1 Test system of DPPH· scavenging activities in vitro μL

式中，A0为乙醇溶液为空白对照测定吸光度值；A1为样品组或阳性对照组测定吸光度值；A2为样品本身对照组测定吸光度值。

1.3.6.2 ABTS+分别配制7 mmol/L ABTS 和2.45 mmol/L 过硫酸钾溶液，等体积混合均匀，室温避光过夜，根据吸光度用无水乙醇稀释20～40倍至吸光度为0.7±0.02，即为ABTS+工作液。柳叶腊梅总黄酮配制成不同浓度（20，40，60，80，100，120 μg/mL）。以96 孔板为反应载体，734 nm 测定吸光度，具体实验操作参照实验体系表（表2）进行，各组实验均重复测定3次，Vc做阳性对照，根据公式计算自由基清除率。

表2 体外ABTS+清除试验体系表Tab.2 Test system of ABTS+ scavenging activities in vitro μL

ABTS+清除率=［（A0-A1+A2）/A0］×100% （3）

式中，A0为乙醇溶液为空白对照测定吸光度值；A1为样品组或阳性对照组测定吸光度值；A2为样品本身对照组测定吸光度值。

1.3.6.3 还原力 需要分别配制0.2 mol/L 磷酸盐缓冲溶液、1%铁氰化钾溶液、10%三氯乙酸溶液、0.1%三氯化铁溶液及不同浓度（20，40，60，80，100，120Methods μg/mL）的柳叶腊梅总黄酮溶液。吸取100 μL样品或Vc 或无水乙醇于离心管中，依次加入200 μL PBS 和200 μL 1%铁氰化钾溶液，混合均匀，50 ℃水浴20 min，再加入200 μL 10%三氯乙酸溶液（如有沉淀，3 000 r/min 离心10 min，如无沉淀，无需离心），取上清100 μL 加入96 孔板，再加入80 μL 蒸馏水和20 μL 0.1%三氯化铁溶液，混合均匀，反应后700 nm测定吸光度。各组实验均重复测定3次，Vc做阳性对照。

1.3.7 柳叶腊梅叶总黄酮中主要抗氧化成分 采用HPLC-DAD 分析主要成分，样品处理及流动相条件均与柳叶腊梅总黄酮的条件一致，具体试剂浓度及剂量详见表3。

表3 ABTS和DPPH自由基反应体系Tab.3 Test system of scavenging ABTS and DPPH radicals

1.3.8 数据统计 采用SPSS 23 软件对数据进行分析，最终结果表示为均值±标准差（M±SD）。采用Origin 2017软件绘制相关线型图。PeakView 1.2分析质谱数据。

2 结果与分析

2.1 柳叶腊梅叶总黄酮百分含量

柳叶腊梅叶经提取、分离、纯化后，以芦丁做标准品，根据芦丁标准曲线计算柳叶腊梅总黄酮的百分含量为（75.33±0.073 7）%。

2.2 LC-MS分析

按照1.3.4 的质谱条件，得到负离子模式下的总离子流图见图2（因所分析物质均在20 min 之前，故总离子流图只展示到20 min）。通过将各色谱峰的保留时间、分子离子峰及碎片离子峰与文献中的研究结果进行比对，对各个峰进行了鉴定，初步鉴定出柳叶腊梅叶总黄酮中14 种化合物：芦丁[15-19]、金丝桃苷[14]、异槲皮苷[15,17-18]、山奈酚-3-O-芸香糖苷[19-20]、木犀草素-5-O-葡萄糖苷[14]、槲皮素-3-O-木糖苷或者槲皮素戊糖苷[20]、山奈酚-3-O-半乳糖苷[21]、紫云英苷[20-21]、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷[19]、山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷[22]、山奈酚-3-O-乙酰半乳糖苷[14,22]、阿福豆苷[19]、槲皮素[15,17-18,23]、柚皮素[24]、山奈酚[17,23]（表4）。

表4 柳叶腊梅叶总黄酮部分主要成分的质谱信息表Tab.4 Negative-ion ESI mass spectra of the main constituents of the total flavonoids of Chimonanthus salicifolius S.Y.Hu.leaves

图2 柳叶腊梅叶总黄酮LC-MS总离子流图Fig.2 The total ions chromatogram of the total flavonoids of Chimonanthus salicifolius S.Y.Hu.leaves

2.3 HPLC分析

柳叶腊梅叶总黄酮的色谱图如图3 所示，通过与标准品相应的保留时间比较，发现9 种黄酮单体物质与标准品保留时间一致。通过加标实验，确定9种黄酮单体物质与标准品一致。色谱峰代表物质及物质在柳叶腊梅总黄酮中含量详见表5。

表5 柳叶腊梅叶总黄酮成分分析Tab.5 Analysis of flavonoids compounds of Chimonanthus salicifolius S.Y.Hu.leaves

图3 标准品与柳叶腊梅叶总黄酮HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatographic of standard samples and Chimonanthus salicifolius S.Y.Hu.leaves

2.4 柳叶腊梅叶总黄酮体外抗氧化活性分析

柳叶腊梅叶总黄酮的体外清除自由基活性和还原能力如图4 所示。图4a 所示，柳叶腊梅叶总黄酮在20～120 μg/mL铁还原能力呈剂量依赖性。在清除自由基实验中，柳叶腊梅叶总黄酮对ABTS+和DPPH·均展示出良好的清除作用，IC50值分别为（54.588±4.117）μg/mL 和（28.053±1.778）μg/mL（图4b，c）。虽然柳叶腊梅叶总黄酮抗氧化能力不如Vc，但仍具有较好的抗氧化活性。

图4 柳叶腊梅叶总黄酮体外抗氧化活性Fig.4 Antioxidant activities of Chimonanthus salicifolius S.Y.Hu.leaves in vitro

2.5 柳叶腊梅叶总黄酮中主要抗氧化成分分析

如图5 所示，通过HPLC 分析确定清除ABTS+和DPPH·的主要物质是槲皮素和山奈酚。图5a 中，ABTS+在此流动相条件下出现单一峰，表明物质为单一物质。加入柳叶腊梅叶总黄酮后，ABTS+峰面积有所减小，同时柳叶腊梅叶总黄酮中的槲皮素和山奈酚峰消失，表明清除ABTS+的主要成分为槲皮素和山奈酚，另外，金丝桃苷、异槲皮苷、木犀草素-5-O-葡萄糖苷、紫云英苷和阿福豆苷的峰面积均有所减少，说明这些成分也具有一定的清除ABTS+作用。图5b中，DPPH·在此流动相条件下未有峰出现，故图中未展示。但加入柳叶腊梅叶总黄酮后，槲皮素和山奈酚对应峰面积减小显著，此外，金丝桃苷、异槲皮苷和紫云英苷峰面积明显减小，表明除槲皮素和山奈酚外，金丝桃苷、异槲皮苷和紫云英苷也具有一定的清除DPPH·能力。

图5 清除ABTS和DPPH自由基的主要活性物质Fig.5 The main active substances for scavenging ABTS and DPPH radicals

3 结论与讨论

柳叶腊梅属于腊梅属植物中的一个种，半常绿灌木[1]，是我国特有的植物种属，主要分布于我国的江西省、浙江省、湖南省、安徽省、福建省，在一些地区又被称为黄金茶、食凉茶等[2-4]。柳叶腊梅含有多糖、黄酮、挥发油等多种活性成分，除此之外，柳叶腊梅中还存在香豆素类、脂肪酸、微量元素、氨基酸和维生素[25-28]。

黄酮类化合物是一类具有生物活性的物质，大量文献报道了黄酮类化合物具有抗氧化[11,29]、抑菌[11]、保肝[13,30]、抗癌[12]、抗炎[29,31]、降血糖[32]等多种功能作用。黄酮类化合物是柳叶腊梅叶中主要成分之一，含量较高，黄酮类单体种类丰富。黄酮类化合物易溶于有机溶剂，利用超声辅助乙醇提取，可以很大程度提高取得率。经过聚酰胺树脂纯化，可以有效的提高柳叶腊梅叶总黄酮的纯度。纯化后的柳叶腊梅叶总黄酮先利用LC-MS，根据文献推测出其具体成分，再采用HPLC 对具体成分进行确定，两种技术共鉴定出9种黄酮类单体物质，9种物质中，山奈酚-3-O-芸香糖苷和阿福豆苷在柳叶腊梅叶总黄酮中首次发现，此外，还有一部分成分具体是何种物质还有待后续实验进行确认。

氧化应激是指体内氧化剂与抗氧化剂之间失衡，更倾向于氧化剂，导致氧化还原信号中断和/或失控引发分子损伤[33-34]。人体多种疾病的发生与发展中均有氧化应激参与，抗氧化剂对于维持机体的氧化/抗氧化平衡具有重要作用。黄酮类化合物作为天然抗氧化剂具有良好的清除自由基和还原能力。本文为探究柳叶腊梅叶总黄酮的抗氧化作用，进行了体外抗氧化实验，包括对ABTS 自由基和DPPH 自由基清除能力的测定及铁还原能力的检测。结果表明，柳叶腊梅叶总黄酮是很好的天然抗氧化活性物质。为探究柳叶腊梅叶总黄酮中起到主要ABTS 自由基和DPPH 自由基清除作用的物质，利用HPLC 进行分析，确定了主要活性物质是槲皮素与山奈酚。本文研究结果为柳叶腊梅具有抗氧化作用提供理论基础，也为柳叶腊梅的开发提供理论依据。