罗伊凡,郑庆玲,顾栋桦,姜梦婷,潘晓英,王晓冉,兰 岚,张 婷

(1.湖州师范学院 医学院，浙江 湖州 313000；2.南京医科大学附属苏州科技城医院 病理科，江苏 苏州 215153)

雄激素受体(AR)基因第一外显子中含有两个三核苷酸重复序列，其由(CAG)n编码的多聚谷氨酸(polyQ)和由(GGC)n编码的多聚甘氨酸(polyG)组成，不同个体间其长度存在多态性.研究发现，AR基因第一外显子CAG重复序列长度与肝癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌的发病风险存在相关性[1-7].而AR基因第一外显子CAG重复序列长度与AR基因的mRNA相对表达水平、HBV相关性肝细胞肝癌临床病理参数的相关性尚需明确.此外，CAG重复序列数在乙型肝炎、HBV相关性肝细胞肝癌(hepatocellular cancer，HCC)及癌旁组织中的差异亦需进一步阐明.因AR基因是雄性激素作用的中介物质，为避免性别对本研究的影响，本文选取男性HBV相关性HCC及男性乙型肝炎患者展开研究.

1 材料与方法

1.1 研究对象的选择与分组

收集2011—2017年在湖州师范学院附属中心医院进行手术切除的83例男性HBV相关性肝细胞肝癌标本，包括癌组织及癌旁组织.部分组织标本离体后立即置于液氮中冷冻保存，剩余组织标本用4%的中性福尔马林固定24 h后常规脱水、石蜡包埋.入组的HCC患者术前均未接受过放、化疗及生物治疗，无饮酒史，无其它类型的肝炎病毒和人免疫缺陷病毒(HIV)合并感染，年龄为33～75岁，中位年龄为46岁.另外,选取45例男性慢性乙型肝炎患者的肝穿刺石蜡包埋组织作为对照组.

1.2 组织样本中核酸的提取

石蜡包埋组织DNA的提取：将经福尔马林固定、石蜡包埋的组织切成厚度为4 μm的切片，经二甲苯(15 min×2次)和无水乙醇(15 min×2次)脱蜡，空气干燥，然后用微量组织DNA抽提试剂盒(QIAGEN公司，德国)进行抽提，抽提的DNA样本于-20 ℃冻存待用.

新鲜组织RNA的提取：将组织用液氮冷冻研磨成组织匀浆，加入Trizol试剂(上海生工公司)，并参照说明书进行操作获得组织的总RNA.总RNA用逆转录试剂盒(美国Promega公司)逆转录得到cDNA，用于实时荧光定量PCR的检测.

1.3 AR基因CAG重复序列数的检测

AR基因第一外显子CAG重复序列的扩增引物：上游引物为5’-TCC AGA ATC TGT TCC AGA GCG TGC-3’，下游引物为5’-ATG GGC TTG GGG AGA ACC ATC CTC-3’，产物大小为167 bp+3n；上游引物5’末端均标记6-羧基荧光素.引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.

PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 45 s，60 ℃45 s，72 ℃45 s，经38个循环后，72 ℃延伸10 min，至4 ℃结束；以无菌去离子水代替模板的阴性对照，以相应的阳性标本作为阳性对照.PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色后，观察目的条带，用ABI 377 DNA测序仪(ABI公司,美国)进行测序，并用Genescan3.7软件分析PCR产物的大小.

1.4 实时荧光定量PCR检测AR基因的mRNA相对表达水平

AR基因的上游引物为5’-TAC CAG CTC ACC AAG CTC CT-3’，下游引物为5’-GCT TCA CTG GGT GTG GAA AT-3’，产物长度为195 bp；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的上游引物为5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3’，下游引物为5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’，产物长度为226 bp.引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.

检测AR基因的mRNA相对表达水平：采用实时荧光定量SYBER Premix Ex Taq试剂盒(Takara公司，日本)，加样体系按试剂盒说明书进行操作，PCR反应在Rotorgen 3000 real-time PCR仪(CorbettLife Science公司，澳大利亚)中完成.反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，经50个循环，随机附带软件计算Ct值和拷贝数，AR基因的 mRNA相对表达水平=AR基因拷贝数/GAPDH基因拷贝数.

1.5 统计学分析

采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，组间重复序列的比较采用t检验，CAG重复序列数与AR基因的mRNA相对表达水平的相关性用Pearson’s相关性检验，P<0.05表示差异具有统计学意义.

2 结 果

2.1 HBV相关性HCC组织中AR基因CAG重复序列的多态性

在所有病例中，含CAG重复序列的AR基因片段扩增成功，见图1.CAG片段的长度为200～248 bp.

注：M为DL2000；1～12为检测样本.图1 PCR扩增CAG重复序列的凝胶电泳图Fig.1 Gel electrophoresis of CAG repeats amplified by PCR

83例HBV相关性HCC组织中CAG重复序列的个数在11～27之间(平均值为19.95±2.75)，其中小于17个的有8例，17个的有5例，18个的有6例，19个的有13例，20个的有12例，21个的有20例，22个的有8例，大于22个的有11例.具体见图2.

图2 肝细胞肝癌组织中AR基因CAG重复序列数分布Fig.2 Distribution of CAG repetitive sequences of AR gene in HCC

本文对83例HBV相关性HCC患者的肝癌组织和癌旁肝组织进行AR多态性检测，发现CAG重复序列数在8例患者的肝癌组织中出现变异，其中5例男性患者的CAG重复序列数减少(23→20，25→23，21→20，22→19，21→19)，3例男性患者的CAG重复序列数增多(21→23，20→21，21→22).具体见图3.

图3 肝细胞肝癌组织中AR基因CAG重复序列变异测序结果Fig.3 Sequencing of CAG repeat sequence variation of AR gene in HCC

如图3(a)所示,相对癌旁肝组织中CAG重复序列(236 bp)，肝癌组织中CAG重复序列出现新的缩短的227 bp(n=20)片段；如图3(b)所示,相对癌旁肝组织中CAG重复序列(213 bp)，肝癌组织中CAG重复序列出现新的增长的219 bp(n=17)片段.

2.2 慢性乙型肝炎肝组织中AR基因CAG重复序列的多态性

45例慢性乙型肝炎肝组织中CAG重复序列的个数在12～31之间(平均值为22.41±3.69)，其中小于17个的有3例，17、19、20、26、28个的分别有2例，21、22个的分别有4例，23个的有7例，24个的有10例，25个的有5例，27、31个的分别有1例.慢性乙肝穿刺组织样本中CAG重复序列的个数明显高于肝细胞肝癌组织样本(t=4.40,P<0.01)和肝癌癌旁肝组织样本(t=4.41,P<0.01)，肝癌组织与癌旁肝组织中CAG重复序列的个数无明显差异(t=0.87,P>0.05).

图4 慢性乙型肝炎肝组织中CAG重复序列数分布Fig.4 Distribution of CAG repetitive sequences of AR gene in chronic hepatitis B liver tissues

2.3 肝癌组织中AR基因的mRNA相对表达水平与CAG重复序列的相关性

采用实时荧光定量PCR检测肝癌组织及癌旁肝组织中AR基因的mRNA相对表达水平，结果得出：肝癌组织中AR基因的mRNA相对表达水平为0.21±0.02，癌旁肝组织中AR基因的mRNA相对表达水平为0.22±0.08，两者无明显差异(t=0.43,P>0.05)；癌旁肝组织中CAG重复序列数与AR基因的mRNA表达呈负相关性(r=-0.67,P<0.01),但肝癌组织中AR基因的mRNA相对表达水平与CAG重复序列数无相关性(r=0.12,P>0.05).

2.4 CAG重复序列的多态性与HBV相关性HCC患者临床病理参数的关系

在HBV相关性HCC组织中，肝癌组织中CAG重复序列数与肝癌的病理分级、癌旁肝硬化情况、肿瘤复发情况、淋巴结转移、感染乙肝病毒的基因型等指标无明显相关性，见表1.

表1 CAG重复序列的多态性与HBV相关性HCC患者临床病理参数的关系

3 讨 论

AR基因位于X染色体的长臂Xq11-12，含8个外显子，其第一外显子区包含两个三核苷酸重复序列(CAG)n和(GGC)n，这些重复序列在AR基因中表现为N端区域的多聚谷氨酸和多聚脯氨酸.AR基因序列的改变可能会引起结构功能的变化，影响AR蛋白DNA结合功能和与配体结合功能的改变，从而引起受AR信号转导通路调节的下游基因表达的改变[8].因此，CAG和GGC重复序列在致病中的作用逐渐被研究者所重视.

Li等对2 000例经病理证实的肝癌患者和对照组进行了大规模的人群病例对照研究，发现AR基因CAG重复序列越长者发生HCC的风险越低，提示AR基因CAG重复序列数可能与肝癌的发生发展有关[1].Yu等对男性肝癌患者血浆中DNA的分析发现，肝癌患者的CAG重复序列数明显低于HBV携带者，并认为CAG重复序列数小于20可能与HBV相关性肝癌的发病风险增高有关[9].钟雪松等研究发现，HBV阳性肝细胞癌(HCC)患者AR基因(CAG)n长度短于HBV阴性HCC患者[10].本研究通过对组织DNA中AR基因(CAG)n多态性的分析，发现男性HBV相关性肝细胞肝癌组织中AR基因的CAG重复序列平均数明显低于男性乙型肝炎患者肝脏穿刺组织该序列平均数(t=4.40,P<0.01)，提示CAG重复序列数较低可能是HBV相关性肝癌发生的危险因素.

Yeh等研究发现，CAG重复序列长度与AR基因的表达和转录活性有关，CAG重复序列数较少可导致AR基因的转录活性上调[11].本研究发现癌旁肝组织中AR基因的表达与CAG重复序列数呈负相关性，表明长的CAG重复序列可能会下调AR基因的表达.但在癌组织中AR基因的表达与CAG重复序列数未见明显相关性，并且AR基因的表达在肝癌组织和癌旁肝组织之间无明显差异.肝癌的发生发展是一个多种复杂因素参与的过程.随着肿瘤的发展，肝癌组织中AR基因的表达可能受到其他因素影响而发生改变，癌旁肝组织中AR基因的表达与CAG重复序列数的相关性提示，AR基因的表达增高可能是促进HBV相关性HCC发生的早期因素.

Yeh等还发现，肝癌组织中AR基因(CAG)n可以发生变异，但这种变异主要表现为三核苷酸重复序列的改变[11].本研究中发现(CAG)n在8例患者的肝癌组织中出现变异，其中5例男性患者的CAG重复序列数减少，3例男性患者的CAG重复序列数增多.这种改变在肝癌中的临床意义还有待进一步研究.

4 结 论

本研究发现，男性HBV相关性肝癌组织中CAG重复序列数明显低于HBV肝炎组，提示CAG重复序列数较低可能是慢性乙型肝炎患者发展成肝细胞肝癌的危险因素；癌旁肝组织中AR基因的表达与CAG重复序列数呈负相关性；肝癌组织中的CAG重复序列会出现一定的变异，但其临床意义还需进一步研究.