贾哲 董海鹏 韩婷 徐文娟 李春帅 刘梦楠 林青华 赵崇军 徐新房 李向日

槟榔是棕榈科植物槟榔ArecacatechuL.的干燥成熟种子，始载于晋代李当之《药录》，在中国有一千多年的药用历史。功效为杀虫，消积，行气，利水，截疟[1]。槟榔幼果为食用槟榔，皮壳一起嚼食，食用后让人有醉酒的感觉，使两颊发红、心跳加快。机体出现以上反应与槟榔中的生物碱类成分有关。两种槟榔各自所含的多种生物碱中，含量最高且起关键作用的都是槟榔碱(arecoline)[2-4]，且前期研究发现食用槟榔中的槟榔碱含量明显低于药用槟榔[5]，血清代谢组学发现药用槟榔水煎液具有一定的心脏毒性[6-7]。槟榔碱可兴奋M-胆碱受体，引起腺体分泌增加，也可兴奋N-胆碱受体，表现为兴奋骨骼肌、神经节及颈动脉等，还具有增加肠蠕动，抑菌、驱虫作用[8]。针对槟榔碱的毒性报道多集中在致口腔粘膜下纤维性变[9-13]、生殖系统[14-15]、神经系统[16]、肝脏[17]和遗传毒性[18]等方面，目前未见对其胚胎发育及心脏毒性的报道。槟榔碱性质不稳定，氢溴酸槟榔碱是其稳定存在形式。

斑马鱼与人类具有87%的基因同源性，可被广泛应用于模型构建、药物毒理学评价等[19]研究。其身体透明，具有可识别的肝脏、心脏等器官，常以有机整体参与实验，可以直观地从整体水平评价药物的毒理作用[20]。发育中的幼鱼组织快速的细胞分裂和分化，特别容易受到外界有毒物质的侵害[21]。

因此本文以氢溴酸槟榔碱为研究对象，探讨氢溴酸槟榔碱对斑马鱼的胚胎发育毒性和心脏毒性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

AB系野生型斑马鱼购置于中国科学院水生生物研究所，养殖于集中式斑马鱼养殖系统(水温28.5℃、光照周期为14小时光照/10小时黑暗)，每日喂食3次活体丰年虾。暗周期开始前选择健康的成年斑马鱼按雌雄比1∶2放入产卵缸内，中间放置隔板，于第二天光周期开始后抽去隔板，半小时后收集鱼卵于干净的培养皿中，胚胎培养液冲洗3遍，在显微镜下挑选受精后6小时且发育正常的胚胎，一部分作为胚胎发育毒性的研究对象；一部分重新放入新的含胚胎培养液的培养皿中，28.5℃恒温培养箱中培养，相同光照条件下发育至受精后4天，于受精后3天在体式显微镜下挑选出健康的斑马鱼幼鱼，作为心脏毒性的研究对象。

1.2 试剂与仪器

氢溴酸槟榔碱标准品(上海诗丹德生物技术有限公司，批号：1344/18868，含量> 99.0%)。NaCl，KCl，Na2HPO4，K2HPO4，MgSO4，CaCl2，NaHCO3，甲基纤维素均为分析纯，购置于北京化工厂。

体视显微镜(Stemi508，卡尔·蔡司股份公司)；TE-2000-S光学倒置显微镜(NIKON)；斑马鱼养殖系统(北京爱生生物科技有限公司)；细胞移液器(10 μL、200 μL、1 mL和5 mL，Eppendorf)；电子分析天平(METTLER TOLEDO)；斑马鱼心跳血流观测软件(MicroZebralab, Viewpoint)；Image J V1.8.0软件(National Institutes of Health)。

1.3 样品制备

斑马鱼胚胎培养液：按照Zebrafish Book标准配制NaCl 0.137 mol/L，KCl 5.4 mol/L，Na2HPO40.25 mol/L，K2HPO40.44 mol/L，CaCl21.3 mol/L，MgSO41.0 mol/L，NaHCO34.2 mol/L的水溶液。

氢溴酸槟榔碱储备液：精密称取25 mg，置于50 mL容量瓶中，加斑马鱼胚胎培养液至刻度，摇匀，即得储备液500 μg/mL。

3%甲基纤维素固定液：将400 mL斑马鱼胚胎培养液置于烧杯中，水浴加热到70℃，边搅拌边加入12 g甲基纤维素，逐渐形成一种淤浆，搅拌后将该淤浆置于冰箱冷却过夜，即得。

1.4 氢溴酸槟榔碱对胚胎发育的毒性研究

1.4.1 药物暴露 将已挑选好的受精后4小时的健康胚胎(透明状受精卵)随机转移进含有不同浓度(200、300、400、500 μg/mL)氢溴酸槟榔碱的12孔板中，每孔20个胚胎，每组设置4孔重复。28.5℃恒温培养箱中培养，每隔24小时更换氢溴酸槟榔碱样品溶液1次并移除死亡的胚胎，以保证溶液中各参数稳定。取不同亲本的胚胎重复实验3次。

1.4.2 氢溴酸槟榔碱对不同发育阶段斑马鱼胚胎发育表型影响的观测 以培养液中发育的胚胎为对照组，通过倒置光学显微镜于受精后24、48和72小时的时间点观察药物暴露后胚胎的发育情况与形态变化，并拍照记录。胚胎的发育情况与形态变化主要关注各时间点鱼体长度、畸形情况和各脏器是否异常及随暴露时间的延长以上各指标的变化。

1.4.3 受精后24小时斑马鱼胚胎自主抽动的测定 记录受精后24小时每个浓度下1分钟内胚胎的自主抽动次数，每个孔取15枚胚胎进行统计。

1.4.4 受精后48小时斑马鱼胚胎心率的测定 记录受精后48小时每个浓度下胚胎10秒内心脏跳动次数，每个孔取15枚胚胎进行统计。

1.4.5 受精后48、72小时斑马鱼胚胎孵化率的测定 统计不同浓度氢溴酸槟榔碱暴露组中斑马鱼胚胎的孵化率(孵化率=已孵化胚胎/总胚胎个数×100%)。由于胚胎在受精后48小时开始孵化，直到受精后96小时完成孵化，因此，分别选择受精后48和72小时统计胚胎的孵化率。

1.5 氢溴酸槟榔碱对心脏的毒性研究

1.5.1 药物暴露 随机选取受精后4天的斑马鱼幼鱼于12孔板中，分别暴露于不同浓度(25、50、100 μg/mL)的氢溴酸槟榔碱中24小时，每孔20尾，每组设置4孔重复。同时，以正常的斑马鱼胚胎培养液为对照组。整个暴露过程在28.5℃恒温培养箱中进行，且整个实验重复3次。

1.5.2 心率、血流指标评价 计算斑马鱼幼鱼心率前，将斑马鱼幼鱼从培养箱中取出放置在室温下30分钟以适应环境温度。不同浓度药物暴露组和对照组中每孔随机选择15只斑马鱼幼鱼，将其固定于3%甲基纤维素中。用发针调整斑马鱼的体位，使其两眼尽量重合，头部与尾部保持在同一水平面上。在体视显微镜下，找到斑马鱼的心脏，在心脏跳动清晰可见时，计数每分钟的心跳次数，每只斑马鱼计数3次。同时，在斑马鱼心跳血流观测软件上截取水平且图象清晰的血管区域，设置60秒录制时间，通过计算该设定时间内的像素变化，计算血流量及血流速。

1.5.3 表型分析评价 不同浓度药物暴露组和对照组中每孔随机选择15只斑马鱼幼鱼，将其固定于3%甲基纤维素中。用发针调整斑马鱼的体位，使其两眼尽量重合，头部与尾部保持在同一水平面上。在显微镜下观察并拍照，用Image J V1.8.0软件测算各组斑马鱼静脉窦(sinus venosus，SV)-动脉球(bulbus arteriosus，BA)即SV-BA间距，每只斑马鱼重复测量3次。

1.5.4 病理组织学评价 在实验暴露终点，使用斑马鱼胚胎培养液将不同浓度氢溴酸槟榔碱暴露组中的斑马鱼幼鱼冲洗三次，转移到干净的含4%多聚甲醛的1.5 mL离心管中，室温保存。在乙醇中逐步脱水，石蜡包埋，切成4～5 μm的薄片后进行HE染色，在显微镜下观察以确认不同浓度氢溴酸槟榔碱暴露处理对斑马鱼心脏组织病理学的改变。

1.6 数据处理

2 结果

2.1 氢溴酸槟榔碱对胚胎发育的毒性研究

2.1.1 氢溴酸槟榔碱对不同发育阶段斑马鱼胚胎发育表型的影响 与对照组胚胎比较，不同浓度氢溴酸槟榔碱暴露组的受精后24小时的胚胎未见明显异常；受精后48小时的幼鱼均见鱼体短小，心囊水肿，心包出血，卵黄囊水肿，脊柱弯曲，尾巴变形，眼部及鱼体黑色素沉积减少，同时均存在不出膜的情况，且给药浓度越高，表现越显著；受精后72小时均见鱼体短小，明显心囊及卵黄囊水肿，脊柱弯曲，尾部畸变，眼部黑色素沉积减少，且给药浓度越高，毒性表现越显著，同时均存在幼鱼游泳缓慢的情况。见图1。

注：红色箭头表示心囊水肿；白色箭头表示卵黄囊水肿；黑色箭头表示脊柱弯曲；白色虚线区域表示尾部畸变。图1 对照组和氢溴酸槟榔碱不同浓度组斑马鱼幼鱼在不同时间点的发育形态(×40)

2.1.2 受精后24小时斑马鱼胚胎自主抽动的测定 由表1可知，不同浓度氢溴酸槟榔碱暴露组与对照组之间具有显著的统计学差异(P<0.01)。随着氢溴酸槟榔碱浓度的升高，斑马鱼胚胎自主抽动次数增加，呈浓度依赖性。

表1 氢溴酸槟榔碱对受精后24小时的斑马鱼胚胎自主抽动次数的影响

2.1.3 受精后48小时斑马鱼胚胎心率的测定 由表2可知，除200 μg/mL浓度组之外，其他浓度氢溴酸槟榔碱暴露组均与对照组之间具有显著的统计学差异(P<0.01)。随着氢溴酸槟榔碱浓度的升高，斑马鱼胚胎心率减缓，呈浓度依赖性。

表2 氢溴酸槟榔碱对受精后48小时的斑马鱼胚胎心脏跳动次数的影响

2.1.4 受精后48、72小时斑马鱼胚胎孵化率的测定 由表3可知，对于受精后48和72小时斑马鱼胚胎的孵化率，不同浓度氢溴酸槟榔碱暴露组与对照组之间具有显著性差异(P<0.01)。随着氢溴酸槟榔碱浓度的升高，受精后48和72小时的斑马鱼胚胎孵化率均降低，且呈浓度依赖性。

表3 氢溴酸槟榔碱对受精后48和72小时的斑马鱼胚胎孵化率的影响

2.2 氢溴酸槟榔碱对心脏的毒性研究

2.2.1 心率、血流指标评价 由表4可知，与对照组比较，100 μg/mL浓度组的斑马鱼心率、血流量和平均血流速三项指标均有显著性差异(P<0.05)。其他浓度暴露组的心率呈现增加的趋势，血流量和平均血流速呈现减少的趋势，且均呈浓度依赖性。见表4。

表4 氢溴酸槟榔碱各浓度组的斑马鱼幼鱼心率、血流量和平均血流速(n=4)

2.2.2 表型分析评价 与对照组相比，50 μg/mL浓度组出现尾巴弯曲，心脏部位未见明显异常；100 μg/mL浓度组出现明显的体长缩短，心囊水肿，卵黄囊水肿等现象。见图2。

药物暴露24小时后各组斑马鱼幼鱼的SV-BA间距见表5。由表5可知， 与对照组比较， 25 μg/mL浓度组的斑马鱼SV-BA间距无显著性差异(P>0.05)；50和100 μg/mL浓度组有显著性差异。组间数据差异随着氢溴酸槟榔碱暴露浓度的增加而增加。

表5 氢溴酸槟榔碱各浓度组的斑马鱼SV-BA距离

2.2.3 病理组织学评价 通过光学显微镜拍照发现，与对照组相比，50、100 μg/mL浓度组的斑马鱼心脏结构改变，形成细小型的管状心脏，心房心室管腔面积明显缩小，心肌壁变薄、心肌细胞数量减少。见图3。

注：黑色箭头表示心囊水肿；白色虚线区域表示尾部畸变；红色双向箭头表示SV-BA距离。图2 对照组和氢溴酸槟榔碱不同浓度组斑马鱼幼鱼的表型观察(×40, ×100)

注：红色箭头表示心脏区域；红色实线区域表示心房心室管腔面积。图3 氢溴酸槟榔碱各浓度给药组的斑马鱼心脏组织病理切片(×100, ×400)

3 讨论

受精后24小时为斑马鱼发育过程中的咽囊期，该时期主要特点为：视网膜和皮肤早期色素沉着，中鳍折叠，卵黄血红细胞出现，心脏开始搏动[22]。与对照组比较，不同浓度氢溴酸槟榔碱暴露的受精后24小时胚胎未见明显异常，分析原因可能是卵膜能够阻止一部分化合物与胚胎接触，对胚胎具有一定的保护作用。胚胎发育至受精后24小时尾部表现出强烈的抽动。自主抽动是斑马鱼运动神经系统未发育完全的表现，不受机体控制，由其运动神经元调控，随着发育过程中神经系统的完善而逐渐减弱。氢溴酸槟榔碱虽未对胚胎的形态发育造成影响，但在某种程度上能够影响胚胎的运动系统或者神经系统的正常发育，使得氢溴酸槟榔碱各浓度暴露组的胚胎活动远强于对照组。

受精后48小时为斑马鱼发育过程中的孵化期(长胸鳍)，该时期主要特点为：出膜成为幼鱼，开始长胸鳍，背上位静息，卵黄变细，视网膜上虹膜色素细胞丰富，头部显著黄色[22]。与对照组比较，不同浓度氢溴酸槟榔碱暴露的受精后48小时的斑马鱼幼鱼的形态发育过程出现较为明显的毒性反应，且呈浓度依赖性。斑马鱼胚胎在受精后48小时心脏已基本发育完全，即出现规律的心跳，此后心率基本趋于稳定，因此心率为胚胎毒性测试实验中一个非常重要的亚致死毒理学指标。结果表明氢溴酸槟榔碱导致斑马鱼胚胎心率明显降低，且呈剂量—毒性效应关系；受精后48小时胚胎进入孵化期，此时的孵化率结果发现氢溴酸槟榔碱可干扰胚胎的正常孵化。

受精后72小时为斑马鱼发育过程中的孵化期(突口)，该时期主要特点为：宽口突出于眼前方，虹膜色素细胞出现于卵黄带且覆盖眼部一半，背部黄色与头部色调一致[22]。不同浓度氢溴酸槟榔碱暴露的受精后72小时的斑马鱼幼鱼的形态发育过程出现明显的毒性反应，且呈浓度依赖性。受精后72小时大部分胚胎孵化完全，此时的孵化率结果表明氢溴酸槟榔碱会干扰胚胎的正常孵化，且浓度越高，孵化率下降越明显，出膜时间延迟，发育停滞，并出现多种严重的畸形。胚胎孵化过程需要消化绒毛膜的酶和机械力的共同作用。脊柱弯曲主要由于肌肉组织损坏，包括肌肉细胞坏死以及肌纤维受损，还与钙离子通道紊乱、脊柱骨原件自身发生畸形有关。氢溴酸槟榔碱对中枢神经存在拟胆碱作用，抑制乙酰胆碱介导的效应，如抑制骨骼肌收缩等作用机制可能是孵化率降低和鱼体畸形的主要原因。

心脏是胚胎发育过程中最早发生并发挥功能的器官，心率是心脏功能正常与否最直观的反映。正常斑马鱼幼鱼的心率一般在120次/分钟左右，本研究中对照组幼鱼的心率为120.60±1.38次/分钟，因此可排除试验中外界环境和遗传因素对斑马鱼心率的影响。与对照组比较，氢溴酸槟榔碱可明显提高幼鱼的心率。血流量也是毒理研究领域中的一个非常有价值的参数。某些心脏问题由于病因的不同，是无法通过心率来测定的，需要通过血流量或血流速检测才能确定。与对照组比较，氢溴酸槟榔碱可使幼鱼的血流量和平均血流速呈现下降的趋势。由于斑马鱼透明，通过显微镜可以清晰观察斑马鱼心脏形态，斑马鱼心脏的发育基本在受精后48小时之内完成。受精后30小时已经形成具有完全功能的心室和心房，受精后36小时心脏发生环化，环化的结果是心房和心室有部分的重叠，心室在心房的右前侧。静脉窦(血液进入斑马鱼心房，SV)和动脉球(血液流出斑马鱼心室，BV)之间的距离将会发生改变。两者之间的大小即SV-BA间距，是评价心脏环化是否正常的指标之一，测量静脉窦和动脉球的间距可用来量化药物对斑马鱼心脏毒性影响的程度[23]。结果发现，氢溴酸槟榔碱可以引起斑马鱼心脏结构的变化，同时改变斑马鱼幼鱼的SV-BA间距，具有心脏毒性。

综上所述，氢溴酸槟榔碱对斑马鱼胚胎发育过程及心脏具有毒性作用，为综合评价槟榔的毒性提供了研究思路，但其更为深入的毒性机制还有待于进一步研究与实践，以期提高槟榔临床使用和日常食用的安全性。