樊雨梅 汝文文 张建岭 解晓 廖峰

摘要 采用蛋白质传统分离技术结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF/MS）揭示驴胎盘蛋白质的性质和组成，结果表明，驴胎盘蛋白含量为（15.62±1.04）%，等电点均匀分布酸性和碱性区域，分子量主要集中在7～19、36～78 kD 2个区域。通过与马科蛋白图库进行对比，检索出3 865种可识别的蛋白，进一步对驴胎盘蛋白进行生物信息学分析，发现驴胎盘蛋白主要参与了内质网蛋白质加工、ECM-受体相互作用、内质网应激反应等生物学过程，为驴胎盘药理活性成分的筛选提供了理论基础。

关键词 驴胎盘;基本特性;蛋白质组分;生物信息学

中图分类号 S-822文献标识码 A文章编号 0517-6611（2021）11-0168-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.11.046

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Analysis of the Composition in Protein from Donkey Placenta

FAN Yu-mei1，2， RU Wen-wen1，2， ZHANG Jian-ling1，2 et al

（1. National Engineering Research Center for Gelatin-based Traditional Chinese Medicine， Donge，Shandong 252201;2. Dong-E-E-Jiao Co.， Ltd.， Donge， Shandong 252201）

Abstract SDS-PAGE gel electrophoresis and MALDI-TOF/TOF/MS were used to reveal the properties and composition of protein in donkey placenta.The results showed that the protein content of the donkey placenta was （15.62±1.04）%， the isoelectric point was evenly distributed in the acidic and basic regions， and the molecular weight was mainly concentrated in the two regions of 7-19 and 36-78 kD. By comparing with the equine protein library， 3 865 identifiable proteins were retrieved， and further analysis of donkey placental proteins was performed. It was found that donkey placental proteins were mainly involved in biological processes such as protein processing in endoplasmic reticulum， ECM-receptor interaction and response to endoplasmic reticulum stress. It provided a theoretical basis for the screening of donkey placenta pharmacologically active ingredients.

Key words Donkey placenta;Basic properties;Protein fraction;Bioinformatics

动物来源药材是我国传统药物的重要组成部分，胎盘作为传统中药，经过长期的实践经验和现代科学研究证明，胎盘及其提取物具有抗氧化[1]、抗疲劳[2-3]、延缓衰老[4]、伤口愈合[5]、调节皮肤炎症[6]、调节免疫[7]和改善肝损伤[8-10]等作用。胎盘的生物活性与其所含有的化学成分密切相关[11-13]。目前研究表明，胎盘富含多种生物成分，包括免疫球蛋白、胶原蛋白、激素、生长因子、细胞因子、氨基酸、酶及微量元素等[12，14]。Togashi等[12，15]研究发现，人胎盘提取物的抗氧化活性与其所含的尿嘧啶、酪氨酸、苯丙氨酸有关。也有研究表明，胎盘蛋白及多肽是胎盘发挥抗氧化、伤口愈合、抗衰老、抗疲劳、免疫调节等作用的物质基础[12-14，16-17]。

近年来，关于胎盘的研究国内外学者主要集中在胎盘成分的检测、动物胎盘功效成分的制备及其功效研究，但蛋白类成分的组成、鉴定研究较少。因此，笔者以驴胎盘为研究对象，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、二维电泳、圆二色谱和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization-time of fight-mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF/MS）等技术手段揭示驴胎盘蛋白质的分子量分布、等电点、二级结构与组成，为驴胎盘的深层次开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

驴胎盘，山东天龙驴产业研究院;乙腈、甲酸、甲醇，均为质谱纯， 百灵威科技有限公司;牛血清白蛋白、尿素、二硫苏糖醇，北京索莱宝科技有限公司;Tris-base，阿拉丁;PMSF，碧云天;Bio-Lyte 3-10 buffer、Ready Strip IPG Strips、Modified Trypsin（Sequencing Grade，Promega）、SDS-PAGE電泳Maker、CGE电泳Maker，美国Bio-Rad公司。

1.2 仪器与设备

全自动凯氏定氮仪（UDK159），意大利VELP公司;SDS-PAGE电泳仪（Mini Protean 3 Cell）、CGE电泳仪（P/ACETM MDQ）、2-DE电泳仪（Protean IEF cell），美国Bio-Rad公司;圆二色谱仪（MOS 450），法国Bio logic公司;MALDI-TOF/TOF-MS（Orbitrap Fusion Lumos Tribrid）、多功能酶标仪（MULTISKAN GO），美国Thermos公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理。

取新鲜驴胎盘样品，用生理盐水冲洗干净，并用手术器械去除筋膜和脐带。生理盐水浸泡并缓慢搅拌5 min，重复数次，直至去除淤血。沥干水分后用液氮速冻，并打成粉末。

准确称取2份5 g胎盘粉末，对于分析用样品加入50 mL 含1 mmol/L PMSF 的Western和IP 细胞裂解液，对于纯化蛋白的样品加入50 mL pH 8.0 含100 mmol/L氯化钠的50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液，使用高速匀浆机在低温下匀浆，匀浆程序为匀浆30 s，间隔15 s。匀浆后离心去除沉淀，上清液即为驴胎盘粗提液。

1.3.2 蛋白质特性的测定。

1.3.2.1 蛋白质含量测定。

采用GB 5009.5—2016中凯氏定氮法[18] 测定驴胎盘中蛋白质的含量。

1.3.2.2 SDS-PAGE电泳测定蛋白质分子量。

方法参考文献[19]。驴胎盘粗提液按体积1∶1加入含二硫苏糖醇的2 × Loading Buffer缓冲液，沸水浴5 min后取出。上样量为10 μL，浓缩胶质量分数为5%，分离胶12%。将凝胶扫描电子图谱保存，电泳所用的marker分子量在7～207 kD。

1.3.2.3 毛细管凝胶电泳（CGE）分析蛋白质相对丰度。

根据田兰等[20]的方法稍作修改。毛细管规格为内径100 μm，总长31 cm，有效长度20 cm，柱体温度40 ℃，电动进样，进样电压-10 kV，进样时间1 s，分离电压-12.4 kV，紫外检测波长280 nm，样品储存温度30 ℃。

1.3.2.4 二维电泳（2-DE）分析蛋白质等电点。

根据Wawrzykowski等[21]的方法，稍作修改。200 μL 驴胎盘粗提液与800 μL的水化液混匀，取200 μL加载到电泳池，准备完毕后，进行等点聚焦程序（表1）。

等电聚焦后立即进行胶条平衡。平衡分两步，每次15 min，分别使用5 mL含1% DTT平衡液1和5 mL含2.5% IAM 平衡液2。平衡结束后进行第二向SDS-PAGE电泳。凝胶用考马斯亮蓝染色后，以脱色液脱去背景颜色，使用凝胶成像设备扫描成电子图片保存。

1.3.3 圆二色谱法检测蛋白质的二级结构。

采用参考文献[22]中的方法，略有改动。驴胎盘蛋白经 0.45 μm 微孔滤膜处理后在190～250 nm远紫外区进行扫描，超纯水作为空白。测定条件：0.1 cm 石英比色杯，温度 25 ℃，光径 0.1 cm，带宽 1 nm，扫描速度 0.5 nm/s，用平均残基摩尔椭圆率[θ]表示 CD 光谱数据，单位 deg·cm2/dmol，并使用 SELCON3 程序估算蛋白质的二级结构（http：//dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml），匹配方式为Closest matching solution with all proteins。

1.3.4 蛋白质组成分析。

驴胎盘经SDS-PAGE分离后，条带平均切成6份，移至 EP 管中。蛋白质的脱色酶切方法参考文献[21]，采用MALDI-TOF/TOF-MS 分析。利用Mascot软件的SwissPort数据库进行搜索。检索分类（Taxonomy）为Equus caballus，Mascot检索P< 0.05和Mascot得分>41分的结果被认为鉴定成功。

1.4 数据分析

每组数据均重复3次，用±SD表示。

2 结果与分析

2.1 蛋白质的基本性质

2.1.1 蛋白质含量分析。

用凯氏定氮法测定驴胎盘蛋白质含量为15.62%±1.04%，与唐文林[23]报道的猪胎盘蛋白质含量为14.67%结果相似。

2.1.2 蛋白质分子量分布。

驴胎盘蛋白电泳条带清晰（图1），分子量均勻分布（7～207 kD），与人胎盘[24]、猪胎盘[14，23，25]、鹿胎盘[26]、马胎盘[27]、羊胎盘[28]、牛胎盘[29]提取物的电泳图模式类似。由图1可知，驴胎盘蛋白中主要含有8条条带，主要分布于7～19和36～78 kD。

2.1.3 不同分子量蛋白质丰度。

胎盘蛋白分子量由低至高均匀分布（图2），且出峰位置非常多，说明胎盘蛋白质种类较多，与前面SDS-PAGE结果一致。由图2可知，驴胎盘蛋白主要分布在35～50 kD。

2.1.4 蛋白质等电点。

驴胎盘蛋白的2-DE电泳结果如图3所示，水平方向为第一向固相pH梯度等点聚焦，垂直向为第二向垂直板SDS-PAGE电泳。驴胎盘蛋白等电点范围分布较广，在酸性和碱性范围内均有相应的等电点蛋白。

2.2 蛋白质二级结构分析

采用圆二色谱法分析驴胎盘蛋白质组分中的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲比例，结果发现，驴胎盘蛋白α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲的比例分别为9.7%、41.2%、21.7%和32.1%，可见驴胎盘蛋白质的二级结构以无规则卷曲和β-折叠为主，推测驴胎盘蛋白富含缬氨酸和异亮氨酸。

2.3 蛋白質组成分析

利用SDS-PAGE结合MALDI-TOF/TOF-MS的方法，总共鉴定出3 865种蛋白质，其中有301种蛋白为未命名蛋白。鉴定的驴胎盘蛋白种类低于Ner-Kluza等[29]报道的4 000多种牛胎盘蛋白，高于Miao等[30]报道的1 198种人胎盘蛋白和Lee等[31]报道的945种猪胎盘蛋白。鉴别出来的驴胎盘蛋白等电点和分子量的分布见图4，这与上面GCE揭示的驴胎盘蛋白分子量分布一致，主要分布在30～50 kD。

通过基因本体论（gene ontology，GO）法对驴胎盘蛋白质分别以其分子功能（molecular function，MF）、生物学过程（biological process，BP）和细胞组成（cell component，CC）3种方式进行归类，揭示驴胎盘蛋白生物学功能，结果见图5。驴胎

盘蛋白参与的生物过程主要是三羧酸循环、翻译、小GTP酶介导的信号转导、糖酵解、ATP水解耦合质子传输、核小体组装、细胞氧化还原稳态、毒素转运、蛋白折叠、内质网应激反应等。驴胎盘蛋白参与形成的细胞组成过程有细胞外泌体、黏着斑、髓鞘、细胞膜、溶酶体膜、内质网、线粒体内膜、内质网膜、线粒体及中间丝的构建等。驴胎盘蛋白参与蛋白质种类最丰富的分子功能为GTP结合、GTPase活性、结构分子活性、聚（A）RNA结合、细胞骨架的结构成分、ATP结合、核糖体的结构成分、GDP结合、NAD结合、钙转运ATP酶活性等。

对驴胎盘蛋白进行KEGG通路分析，寻找驴胎盘蛋白集中的生物学信号通路，以期了解驴胎盘蛋白主要参与的生物信号通路，为后续驴胎盘蛋白功效研究提供依据。驴胎盘蛋白参与的KEGG信号通路主要有抗生素生物合成、碳代谢、吞噬体、糖酵解/糖异生、黏着斑、代谢途径、胞吞作用、TCA循环、内质网蛋白质加工、ECM受体相互作用、肌动蛋白细胞骨架调控、白细胞穿越内皮迁移、氧化磷酸化等。驴胎盘蛋白信号通路的富集结果为进一步深入了解驴胎盘蛋白可能的生物学意义，阐明驴胎盘提取物发挥伤口愈合、延缓衰老、抗皱和改善肝损伤等药理活性的机制提供新的途径和线索。

驴胎盘参与ECM受体相互作用信号通路的相关基因为ECM中的collagen、fibronectin、THBS2等和细胞膜上的整合素、CD44、syndecan、CD36、CD47，从另一角度证实了胎盘水溶性提取物治疗伤口愈合与整合素α5β1介导炎症因子调控纤连蛋白促进细胞的迁移和吞噬有关[32]。已有研究表明，黏着斑、ECM受体相互作用、肌动蛋白细胞骨架调控等信号通路中的调控因子在骨骼肌生长发育过程中发挥着重要的作用[33]，为驴胎盘肽促进骨骼肌成肌细胞增殖的作用机制和机理提供了新的途径和线索[34]。

3 结论

该研究采用SDS-PAGE凝胶电泳、二维电泳、圆二色谱和MALDI-TOF/TOF/MS等手段揭示驴胎盘的性质与组成，结果表明，驴胎盘蛋白质的含量为15.62%±1.04%，等电点分布在酸性和碱性区域，分子量主要集中在7～19和36～78 kD 2个区域;驴胎盘蛋白二级结构主要以β-折叠和无规则卷曲为主。通过与马科蛋白图库进行对比，检索出3 865种可识别的蛋白。GO分类和KEGG通路分析显示，驴胎盘蛋白主要富集在GTP结合、GTPase活性、小GTP酶介导的信号转导、抗生素生物合成、糖酵解/糖异生、代谢途径、胞吞作用、TCA循环、内质网蛋白质加工、ECM-受体相互作用等。该研究为进一步探究与驴胎盘药理活性相关蛋白质组分、生物活性肽的开发提供数据支撑，明确驴胎盘蛋白成分发挥药理活性的机制提供了新的途径和线索。

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