徐静琳　孔祥静　　韩颖敏　　陶海英

[关键词] 舒洛地特;微小RNA-27a;自噬;糖尿病肾病;足细胞损伤

[中图分类号] R285.5;R587.205          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）14-0039-06

Mechanism research of sulodexide in regulating miR-27a-mediated autophagy in regulation of podocyte injury in diabetic nephropathy

XU Jinglin1   KONG Xiangjing1   HAN Yingmin1   TAO Haiying2

1.Department of Nephrology， the First People′s Hospital of Taizhou City in Zhejiang Province， Taizhou   318000， China; 2.Department of Endocrinology， the First People′s Hospital of Taizhou City in Zhejiang Province， Taizhou 318000， China

[Abstract] Objective To analyze the mechanism of sulodexide in regulating microRNA-27a（miR-27a）-mediated autophagy in the regulation of podocyte injury in diabetic nephropathy. Methods Fifteen of the 45 rats were selected as the normal group without any treatment， and the remaining rats were used to establish a diabetic nephropathy rat model and randomly divided into the model group and the sulodexide group with 15 rats in each group. Rats in the sulodexide group were given intramuscular injection of sulodexide， while those in the normal group and the model group were given intramuscular injection of equal volume of normal saline. Histopathological changes， blood glucose， blood lipid and renal function indexes， podocyte autophagosome status， apoptosis rates， and podocyte specific protein expression levels， including Nephrin， Desmin， GPR124， miR-27a and AMPK-mtor signaling pathway protein were observed. Results The blood glucose， lipid and renal function indexes， podocyte apoptosis rates， Desmin， miR-27a and AMPK-mtor signaling pathway protein expression levels in the sulodexide group were lower than those in the model group，with significant difference（P<0.05）. The number of podocyte autophagosomes， the protein expression of Nephrin and GPR124 in the sulodexide group were higher than those in the model group，with significant difference（P<0.05）. Conclusion Sulodexide can mediate the reduction of the expression of AMPK， mTOR and Bax proteins by decreasing miR-27a， and then inhibit the AMPK-mTOR signaling pathway， promote autophagy， inhibit apoptosis and reduce the injury of podocytes in diabetic nephropathy.

[Key words] Sulodexide; miR-27a; Autophagy; Diabetic nephropathy; Podocyte injury

随着人们生活水平的不断提高，糖尿病及其并发症的发病率呈逐年上升的趋势，严重影响人们的生活质量，其中糖尿病肾病（Diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最严重的微血管并发症之一，目前已成为导致终末期肾病（End-stage renal disease，ESRD）的主要原因之一[1-2]。有数据显示[3]，我国DKD的患病率为20%～40%，此病起病较为隐匿，一旦进入大量蛋白尿期后，进展至ESRD的速度显著加快，因此，早期诊断、预防与延缓DKD的发生发展对提高DKD患者存活率、改善其生活质量具有重要意义。有研究显示[4]，微小RNA-27a（microRNA-27a，miR-27a）在DKD患者体内呈异常高表达，可刺激系膜细胞外基质合成增加即降解减少，加重DKD进展。目前临床研究证实[5]，舒洛地特是从动物小肠分离提取沉淀而成的一种天然血管壁糖胺聚糖，具有较高的血管趋向性且对糖尿病尿蛋白的发生具有防治作用。但miR-27a在DKD中的调控机制尚未十分清楚，故本研究旨在探讨舒洛地特调控miR-27a介导自噬调控糖尿病肾病足細胞损伤机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取45只雄性SPF级大鼠，购自冠科生物技术（中山）有限公司，动物许可证号：SYXK（粤）2020-0240，平均体重（218.63±32.45）g，在相对湿度为30%～35%、平均温度（23.8±1.5）℃下饲养1周，每日光照24 h。本实验操作均严格参照动物实验伦理要求相关规定进行，且获得我院医学伦理委员会审批同意。

1.2方法

1.2.1 仪器及试剂  血糖仪、血糖试纸购自上海信帆生物科技有限公司;普通光学显微镜购自上海普赫光电科技有限公司;链尿佐菌素（Streptozotocin，STZ）购自上海恪敏生物科技有限公司;AMPK抗体购自武汉菲恩生物科技有限公司;mTOR抗体购自爱必信（上海）生物科技有限公司;Bax抗体购自上海振誉生物科技有限公司。

1.2.2 分组及建模  选取45只中15只大鼠作为正常组不做任何处理，其余大鼠均参照邓文荣等[6]研究建立糖尿病肾病大鼠模型，随机分为模型组、舒洛地特组各15只，大鼠均使用高糖高脂的饲料喂养2周后腹腔注射50 mg/kg避光溶解于pH=4.28柠檬酸钠缓冲液的STZ溶液，注射7 d后取大鼠尾部静脉血进行空腹血糖监测并收集尿液监测尿肌酐、尿微量白蛋白，建模成功标准：血糖水平≥16.7 mmol/L及尿肌酐、尿微量白蛋白显著高于正常组;此外，正常组常规饲养。

1.2.3 给药方法  舒洛地特组大鼠给予10 mg/（kg·d）舒洛地特肌内注射，正常组和模型组给予等体积生理盐水肌内注射。

1.3 观察指标

1.3.1 病理组织学观察  在大鼠建模成功后12周，采用2%戊巴比妥钠对大鼠麻醉后暴露其心脏，采用快速针刺入心尖部采血;随后颈椎脱臼法处死小鼠并迅速解剖摘取其肾脏，将肾脏纵向对半切开并去除筋膜，取1/4肾组织固定于使用冷生理盐水漂洗后去除血液，使用滤纸吸干。采用10%福尔马林固定后，将固定液倒出并用水冲洗浸泡1 d，换水1 h/次，将组织修出平整的切面，使用乙醇進行分级梯度脱水，将标本置于二甲苯溶液中并拧紧盖子，更换二甲苯40 min/次，进行透明处理，将标本置于58℃箱内，90 min/次，重复2次，进行透腊处理，将其常规切片、封片后，在光学显微镜下观察病理学变化。

1.3.2 血糖、血脂和肾功能指标评价  采用上海帝博思生物科技有限公司的PUZS-300全自动生化分析仪检测血糖（Blood sugar，BG）、三酰甘油（Triglyceride，TG）、总胆固醇（Total cholesterol，TC）、血肌酐（Serum creatinine，Scr）、尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）、24 h尿白蛋白排泄量（Urinary albumin excretion，UAE）。

1.3.3 足细胞自噬体情况、凋亡率评价  采用上海经科化学科技有限公司的透射电镜观察足细胞自噬体情况;采用默瑞（上海）生物科技有限公司的DxFLEX流式细胞仪检测足细胞凋亡率

1.3.4 足细胞特异性蛋白肾病蛋白（Nephrotic protein，Nephrin）、结蛋白（Desmin）、G-蛋白偶联受体124（G protein-coupled receptor 124，GPR124）评价  采用RT-PCR法检测Nephrin、Desmin、GPR124表达，实验步骤：将1 mL TRNzol加入癌组织、癌旁组织取总DNA并检测其纯度和浓度，提取2 μg总DNA并加入内参GAPDH及目的小分子RNA Nephrin、Desmin、GPR124逆转录引物，42℃ 15 min，85℃ 5 s，逆转录合成cDNA;PCR反应条件：95℃ 预变性10 min，95℃、60℃、95℃、60℃、95℃时间分别12 s、40 s、15 s、30 s、15 s（收集荧光），40个循环，使用Primer5.0软件对引物序列进行设计，Nephrin引物序列上游：5'-CCTGTGAAACCTCGGGAATA-3'，下游：5'-GACCGAGTCAGGAACGAATA-3';Desmin引物序列上游：5'-TGAAGAGGAGATCCGTGAG-3'，下游：5'-AGTGAGGTCTGGCTTAGA-3';GPR124引物序列上游：5'-ATGGAGCTGAGCGCCTTTCCC-3'，下游：5'-TCCAACCCAAGGTCAGGCCCAT-3';内参GAPDH引物序列上游：5'-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3'，下游：5'-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3'。

1.3.5 miR-27a、单磷酸腺苷活化蛋白激酶（Adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路蛋白表达量评价  采用Western blot法检测肾脏组织miR-27a、AMPK-mTOR信号通路蛋白表达量，实验步骤：将肾脏组织接种于6孔板中，24 h贴壁后各组进行处理，将采集到的样本研磨加入蛋白缓冲液，提取细胞蛋白并使用BCA法测定浓度，制备电泳样品，上样量50 μg进行SDS-PAGE电泳，蛋白转至PVDF膜，加入脱脂奶粉封闭1 h，一抗（1∶1000）4℃ 孵育过夜，洗膜5 min/次，共3次，二抗（1∶4000）室温孵育1 h，洗膜5 min/次，共3次，加入发光液曝光3～4次，取重叠值。采用软件分析蛋白条带灰度值，内参蛋白为GAPDH。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0统计学软件进行分析处理。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差齐性检验，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠病理组织学观察

正常组肾组织形态未见明显异常，肾间质、肾小球和肾小管的结构基本正常;模型组肾组织可见肾小球毛细血管袢肥大、系膜基质增多、肾小囊腔狭窄及肾小管出现管腔扩张、纤维化或萎缩，出现水肿和炎症细胞浸润，且可见空泡样变性，上皮细胞出现变形、脱落和部分坏死;舒洛地特组肾脏病理损伤较模型组可见有所减轻。

2.2 各组大鼠血糖、血脂和肾功能指标比较

舒洛地特组、模型组血糖、血脂和肾功能指标均高于正常组， 差异有统计学意义（P<0.05）;舒洛地特组血糖、血脂和肾功能指标均低于模型组， 差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 各组大鼠足细胞自噬体情况、凋亡率比较

正常组大鼠足细胞足突正常、线粒体和内质网结构正常;模型组大鼠足突明显增宽、融合，基底膜明显增厚，足细胞内质网损伤明显且呈空泡样变;舒洛地特组较模型组足突融合及基底膜增厚明显减轻，足细胞内质网损伤有所减轻。见图1～2。舒洛地特组、模型组足细胞自噬体数量少于正常组，凋亡率高于正常组，，差异有统计学意义（P<0.05）;舒洛地特组足细胞自噬体数量多于模型组，凋亡率低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.4 各组大鼠足细胞特异性蛋白Nephrin、Desmin、GPR124蛋白表达量比较

舒洛地特组、模型组Desmin蛋白表达量高于正常组，Nephrin、GPR124蛋白表达量低于正常组， 差异有统计学意义（P<0.05）;舒洛地特组Desmin蛋白表达量低于模型组，Nephrin、GPR124蛋白表达量高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.5 各组大鼠miR-27a、AMPK-mTOR信号通路蛋白表达量比较

舒洛地特组、模型组miR-27a、AMPK-mTOR信号通路蛋白表达量均高于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）;舒洛地特组miR-27a、AMPK-mTOR信号通路蛋白表达量均低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨論

DKD的病理发病机制复杂，受肾脏血流动力学异常、血糖值高导致的代谢变化、高血压及血管活性物质代谢异样及遗传因素等影响，目前临床上治疗DKD的药物存在疗效长、副作用多及费用昂贵等劣势，进一步探索DKD的发病机制，找寻安全有效治疗策略一直是糖尿病领域的热点话题[7-8]。有研究显示[9-10]，舒洛地特在DKD治疗中具有减少蛋白尿的肾脏保护作用，还具有抗凝、抗栓、保护血管内皮等作用，其作用机制可能为舒洛地特可补充DKD患者丢失的阴离子成分糖胺聚糖（Glycosaminoglycans，GAGs）、修补肾小球基底膜结构并恢复电荷屏障以减少尿蛋白丢失，降低DKD患者的尿蛋白水平。miRNA在人类的多种疾病中均可发挥调控作用，其在糖尿病肾病中亦具有重要作用，miR-27a-3p在DKD患者体内呈异常高表达，高表达miR-27a-3p对肾纤维化具有促进作用[11]。本研究结果显示，舒洛地特可下调miR-27a表达，对肾纤维化起一定的保护作用，为DKD的治疗奠定基础。

DKD的病理改变包括肾小球细胞外基质积累及基底膜增厚，但特征性标志为蛋白尿，但越来越多研究发现[12]，足细胞参与DKD蛋白尿的发生，是DKD发病与进展的中心靶点。足细胞是终末分化的细胞，其再生能力有限，在糖尿病等应激因素的作用下，大量的蛋白和细胞器积聚在足细胞内并产生毒性作用，若未得到有效清除将会诱发细胞凋亡或死亡，进而引起足细胞损伤和功能失调等不可逆性变化并导致足细胞缺失[13-14]。在正常情况下，足细胞有着较高的自噬活性可清除受损的蛋白和细胞器，从而免受损伤。本研究结果显示，DKD患者体内足细胞存在一定损伤，舒洛地特可通过下调miR-27a介导自噬，缓解DKD足细胞损伤，延缓疾病进展。

临床上将Nephrin视为肾小球足细胞损伤的重要标志物，其是构建足细胞裂空隔膜的关键蛋白且特异性地在肾小球足细胞中表达，在高糖等应激条件下易导致Nephrin表达减少，从而导致裂空隔膜破坏和大量蛋白尿[15]。在吴欣等[16]研究中，Desmin是一种细胞骨架中间丝蛋白，在正常情况下仅在系膜细胞中少量表达，但当足细胞受损时，其表达显著增加，故可作为足细胞损伤的标志蛋白。GPR124为G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPR）家族中的孤儿受体，其在DKD患者体内呈低表达，上调其表达可增强细胞的自噬功能、减少细胞凋亡，发挥对足细胞功能的保护作用[17]。本研究结果显示，足细胞内可通过下调miR-27a促进Desmin蛋白表达量下调，Nephrin、GPR124蛋白表达量上调，进而缓解足细胞损伤，对足细胞发挥一定保护作用。

临床研究证实[18-19]，AMPK-mTOR信号通路表达异常在DKD足细胞损伤中起着重要作用，可通过对此信号通路进行调节，进而激活足细胞自噬、改善足细胞损伤，起到抗DKD的作用。AMPK是一种重要的受体且是自噬的主要调节剂，活化的AMPK对mTOR具有负调节作用，在富含氨基酸和生长因子营养充足时，细胞中mTOR被大量激活并阻断自噬通路[20]。mTOR是抑制自噬过程的一个主要因素，其主要通过磷酸化下游靶蛋白实现对自噬过程的抑制，足细胞mTOR的激活在DKD进展过程中表现出非常重要的作用，减少足细胞mTOR的激活可延缓DKD的进展[21]。mTOR可刺激缺氧诱导因子1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的堆积，进而促进血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）的分泌及表达，进而加速DKD的进展。Bax在病变生物体内呈低表达，参与机体内多种细胞的增殖、凋亡过程，其中细胞凋亡是一种主动连续的程序化反应，Bax过剩有助于细胞死亡[22]。本研究结果证实AMPK-mTOR信号通路参与糖尿病肾病足细胞损伤中自噬的调节，其机制可能为通过调节此信号通路相关蛋白进一步激活自噬，足细胞损伤情况也随着自噬的激活而有所改善。

综上所述，舒洛地特可通过下调miR-27a抑制AMPK-mTOR信号通路介导自噬调控糖尿病肾病足细胞损伤并发挥对足细胞的保护作用，为临床治疗DKD提供了新的理论依据，但具体机制还有待进一步的科学研究。

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（收稿日期：2020-06-03）