刘琦涛，黄志艺，孙延杰，马晓丹，杨培奎

（韩山师范学院 生命科学与食品工程学院，广东 潮州 521041）

牛蛙（Rana catesbiana）属于两栖纲（Amphibia）、无尾目（Anura）、蛙科（Ranidae），原产于北美洲和墨西哥等地，是各地食用蛙中的主要养殖种类［1］.自上世纪90年代大力推广牛蛙养殖以来，经过多年的发展，牛蛙的养殖基本覆盖全国各地，据统计，早在2013年我国牛蛙的养殖年产量已超过15万吨［2］.

随着养殖规模和养殖密度的不断增大，以及养殖技术依旧粗放而绿色健康饵料供不应求等问题日益突出，牛蛙养殖环境不断恶化，病害频发.其中，富营养化废水的排放更成为多地禁止牛蛙养殖的重要原因之一，废水中的病原微生物也是导致近年来牛蛙病害频发的重要原因.为了尽快明确养殖环境导致牛蛙病害频发的病原微生物以及寻找防治措施，本研究运用传统的细菌分离培养方法，从牛蛙养殖场的淤泥中分离细菌，结合理化特性以及16 S rRNA 扩增和系统发育进化分析，鉴定病原.同时，对分离细菌的耐药性以及致病力进行分析，以期为牛蛙养殖过程中环境致病菌的科学防治提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料来源

池塘底泥采自广东省汕头市澄海区盐鸿镇牛蛙养殖场的池塘底部；成体幼蛙购自同一地区的种苗繁育基地，开展实验前在实验室暂养5-7天.

1.1.2 主要试剂和仪器

肠杆菌科细菌生化鉴定管、药敏纸片，杭州微生物试剂有限公司；2×Taq PCR StarMix、琼脂糖，北京康润诚业生物科技有限公司；细菌通用引物27F 和1492R，由华大基因科技有限公司合成.SHP-150型生化培养箱，上海精宏实验设备有限公司；……