李雪莹 山东中医药高等专科学校

金银花因所具疏风散热、清热解毒功效而于临床常用，是传统方剂银翘散的主要成分。其在《中国药典》有所收载，多项现代药理实验已证实，其具抗心肌缺血、抗炎、神经保护、抗病毒、调节免疫等系列作用[1]。就金银花特性而言，其自忍冬科植物忍冬的初开花或干燥花蕾为来源。在药典（2015版）中，已明确将华南忍冬、近缘种红腺忍冬、黄褐毛忍冬、灰毡毛忍冬列为山银花。经调查在既往，将金银花和山银花均归为金银花范畴进行使用，因此金银花误用现象一直较为严重。由于形态上的相似性，市场上时常出现以次充好的情况，比如以山银花药材充当金银花，引发市场混乱，故提高检测力度意义显著。但在对中药金银花分子真伪进行鉴别时，存在较大难度，分析原因，首先，因对于金银花种及变种而言，在化学成分和形态学方面均具高度相似性，采取传统手段进行鉴别时，较较大难度；另一方面，金银花有较广的引种栽培面积，各产地在生态环境方面存在较大差异，产地不同，化学成分和形态也表现有较大的差别的情况，应用化学、形态学、甚至药理方案展开鉴别，在结论上易存有争议。因此，为了鉴定和评价金银花和各品种山银花性状的差异，品质的差异及不同种质之间的亲缘关系，急需建立科学性强、使用方便的新种质鉴别方法。

分子标记技术可划分为如下四类：其一，基于分子杂交技术，如RELP，因实验操作的繁琐性及时效性较差、成本较高等问题而应用受限；其二，基于PCR技术，如PAPD、ISSR，可谓近年呈最为迅猛发展、最广应用范围的分子标记技术；其三，基于DNA序列分析，如ITS，对药用植物鉴别较为有利，与基于PCR技术的分子标记技术一样获得了较快发展[2]；其四，基于限制性酶切与PCR技术。以下即针对最为广泛的金银花药材鉴定所采用分析标记技术予以列举与分析。

一、ITS序列测序技术

现行分子标记中，ITS序列的应用表现为最为频繁的情况，作为极具特色的内转录间隔区，包括ITS1、ITS2两部分，观测其长度均在300bp以内，而对于大部分被子植物而言，长度均在700bp以下，极为便宜开展分子操作。对于易于混淆中药材及其本身的鉴别，分子鉴别技术如DNA条形码等正异军突起，获广泛应用[3]。冯图等[4]对“金银花”及易混药材的鉴别研究中，以不同序列DNA条形码予之以检测，得出matK、ITS、trnl-tmF序列可达到有效鉴别目的，可视为候选。刘震等[5]则取通用序列实施对忍冬科植物DNA条形码的筛选工作，得出ITS2可判断为候选，psbA-trnH序列可为其补充，但有一点需注意，ITS2序列并不能对忍冬属物种予以完全鉴定出，同时亦不能精准区分灰毡毛忍冬、黄褐毛忍冬。Wang 等[6]在结合化学活性物质、形态学特征的基础之上，采用ITS序列对“金银花”及近缘种进行鉴别。崔志伟等[7]则通过psbA-trnH、ITS2序列，成功实现了来自不同地区（河南、山东、河北、山西）不同种质“金银花”的鉴别工作。王冲之等[8]经缜密思索，经对退火温度提高、添加改性剂等途径，使“金银花”rDNAITS区扩增效率得以较大幅度提升，推动了植物来源DNA模版PRC扩增问题的有效解决。nrDNA非转录间区，即ITS区，在近年的植物药材分子鉴定中已获越来越广泛的应用[9、10]。而伴随着分子标记技术日新月异的发展进程，经ITS序列对中草药实施分子鉴定的相关技术日臻成熟，渐趋用于越来越多的中草药鉴定，以其差异性完成分相关分析与系统的鉴定事宜。

二、叶绿体基因区段规范性测序技术分析

叶绿体基因对于中草药分子鉴定拥有举重若轻的作用，其作为重要的分子标记，所具特点及优势分析如下：其一，cpDNA呈结构简单、分子量小以及多拷贝特点，对叶绿体基因组可行有效分析。其二，相对具有较多重复序列核基因或频繁重排线粒体基因组来讲，叶绿体基因较为保守，进化速率仅为核基因1/3，具体为每年每个位点平均值约为0.2-1.0×10-9，以于碱基缺失、点突变或是插入为主要突变类型。另外，据观察，相较于编码区，叶绿体非编码区DNA呈现出更快的进化速率，此特点使之可更加适应与满足不同分类水平系统演化需要。其三，具单性遗传特性，不必依赖于其他数据即可对分子系统树予以构建，即具独立进化路线，可依托于系统与历史发育对生物多样性进行解释，并提供精准且可靠信息。经此，对叶绿体基因区段相关测序技术展开构建操作，可为中草药的有效分析鉴定打下良好基础。

三、随机扩增多态性DNA（Rando m Amplified Polymorphism DNA，RAPD）

PAPD技术，其本质即分析DNA经PRC扩增后所赋予的多态性的变化，继而进行精准有效的对所检测目标生物体内在基因排布与外在性状表现的判断[11]。王文炳[12]以山东省平邑县为地理范围，以3个品系的金银花遗传信息为检测标的，经检测，新种质所表现出的遗传距离亲缘关系，相较毛花品系，与鸡爪花系更近。王一斐等[13]则以胶东地区为地理范围，以31个金银花种质为检测标的，经PDPD法检测，探讨不同种质间所表现出的遗传关系，结果示，“金银花”种源不同，也具遗传多样性特征，且遗传关系与地理分布具相关性。此外，因PAPD技术灵敏度高、操作简单，且成本低，进而使得相关的中草药鉴定研究报道较多。但在稳定性方面，该技术仍存在欠缺，具有较低的可重复性，需与其他细胞学、分子生物学等联合使用，以使结果的可信度增强。

四、简单重复序列间区（ISSR）特征

对于ISSR分子标记，其常用引物即为锚定微卫星DNA，属分布于SSR序列中在3’或 5’端区域的随机核苷酸，锚定引物可致其互补间隔呈较近显示的重复序列间分布的DNA片段表现为PCR扩增状态。同时，由此扩增的Inter-SSR处多个条带的分辨与鉴定可经由琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳完成。该技术有机结合了PAPD、SSR的优点，同时可对更多基因组DNA信息予以提供。王晓明等[14]以该技术对来源于山东、河南与湖南三地的22个金银花种质实施遗传多样性分析，结果所示，ISSR技术可为金银花种质的相关鉴别工作，并促进种质资源高效利，同时，也可就理论依据向分类操作提供，即可对其遗传多样性予以有效分析。韩琳娜等[15]选取三大道地产区生长的27个金银花植质资源行ISSR遗传多样性分析，结果示，其多态性比率经测定得出的结果为88.4%，遗传的相似系数介于0.50～0.90之间，表明地域不同，金银花在遗传上表现为较大差异，可作为鉴别要点，以促进资源合理应用。该技术近年来广泛用于种质资源遗传多样性研究、种质鉴定中，同时对于中草药鉴定亦具广阔前景。

因高效、精确及可靠性，分子标记获迅速发展。当前阶段下，该技术已在分析系统学、植物分类、系谱分析、遗传多样性、基因型标记以及种质指纹图谱绘制等诸多领域获得广泛应用与发展，并在中草药鉴定中另辟蹊径，提供了新的思路与方向。