何文栋 苏雯清 韦坤华 奎玲 王硕 龚小妹 杨晓男 缪剑华

中图分类号 R285 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2021）10-1196-09

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.10.07

摘 要 目的：研究染料木素对人鼻咽癌CNE1细胞生长的抑制作用并预测其可能的作用靶点。方法：采用CCK-8法检测0（空白对照）、12.5、25、50、100、150 ?mol/L染料木素分别作用24、48、72 h对CNE1细胞增殖的影响;分别采用流式细胞术检测0（空白对照）、15、30、60 ?mol/L染料木素作用24 h对CNE1细胞周期、凋亡的影响;采用划痕实验检测0（空白对照）、10、20、30 ?mol/L染料木素作用24 h对CNE1细胞迁移能力的影响。采用高通量测序法挖掘0（空白对照）、30 ?mol/L染料木素作用24 h后CNE1細胞中的差异基因，并通过实时荧光定量-聚合酶链式反应法（RT-qPCR）对上述细胞实验相关差异基因mRNA的表达情况进行验证。结果：与空白对照比较，12.5、25、50、100、150 ?mol/L染料木素对细胞的增殖均有显著的抑制作用（P<0.01），且呈浓度-时间-效应趋势;15、30 ?mol/L染料木素可使细胞周期阻滞于G0/G1期（P<0.05或P<0.01），30、60 ?mol/L染料木素可使细胞周期阻滞于G2/M期并显著促进其凋亡（P<0.05或P<0.01）;10、20、30 ?mol/L染料木素可显著抑制细胞的迁移能力（P<0.01）。高通量测序共挖掘出2 271个差异基因（padj<0.05），其中1 154个基因上调、1 117个基因下调;结合细胞实验结果共筛选出p53、p21、STC2、FGF2、CDK6、CYCLIN D、PI3K、AKT等8个潜在靶点差异基因。经RT-qPCR法验证，其中p53、p21、STC2、FGF2、CDK6、CYCLIN D、AKT等7个潜在靶点差异基因mRNA的表达均显著下调（P<0.05），与转录组测序结果基本一致。结论：染料木素能有效抑制人鼻咽癌CNE1细胞的生长;其抗鼻咽癌机制可能与抑制突变型p53基因的表达，恢复野生型P53蛋白功能以及抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路的活性有关。

关键词 染料木素;人鼻咽癌CNE1细胞;高通量测序;突变型p53基因;磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路

Inhibitory Effect and Target Prediction of Genistein on the Growth of Human Nasopharyngeal Carcinoma CNE1 Cells

HE Wendong1，SU Wenqing2，WEI Kunhua3，4，KUI Ling5，WANG Shuo6，GONG Xiaomei6，YANG Xiaonan3，4，MIAO Jianhua1，2，3，4，6（1. Pharmacy College， Guangxi University of TCM， Nanning 530200， China;2. Pharmacy College， Guangxi Medical University， Nanning 530021， China; 3. Guangxi Key Laboratory of Medicinal Resources Protection and Genetic Improvement， Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants， Nanning 530023， China; 4. Guangxi Engineering Research Center of TCM Resource Intelligence Creation， Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants， Nanning 530023， China; 5. Pharmacy College， Jiangsu University， Jiangsu Zhengjiang 212013， China; 6. National Engineering Laboratory of Southwest Endangered Medicinal Resources Development， Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants， Nanning 530023， China）

ABSTRACT   OBJECTIVE： To study the inhibitory effects of genistein on the growth of human nasopharyngeal carcinoma. CNE1 cells and predict its potential target. METHODS： CCK-8 method was used to test the effects of 0（blank control）， 12.5， 25， 50， 100， 150 ?mol/L genistein on the proliferation of CNE1 cells after treated for 24， 48， 72 h. Flow cytometry was carried out to detect the effects of 0（blank control）， 15， 30， 60 ?mol/L genistein on the cell cycle and apoptosis of CNE1 cells after treated for 24 h. Scratch test was used to investigate the effects of 0（blank control）， 10， 20， 30 ?mol/L genistein on the migration ability of CNE1 cells after treated for 24 h. High throughput sequencing was conducted to discover the differential genes in CNE1 cells after treated with 0 （blank control）， 30 ?mol/L genistein for 24 h. RT-qPCR assay was adopted to verify the mRNA expression of related differential genes in above trials. RESULTS： Compared with blank control，12.5， 25， 50， 100， 150 ?mol/L genistein showed significant inhibitory effect on the proliferation of CNE1 cells （P<0.01）， in a concentration- time-effect manner;15， 30 ?mol/L genistein could arrest CNE1 cell cycle at G0/G1 stage （P<0.05 or P<0.01）; 30， 60 ?mol/L could arrest CNE1 cell cycle at G2/M stage and promoted cell apoptosis （P<0.05 or P<0.01）. 10， 20， 30 ?mol/L genistein could significantly inhibit the migration ability of CNE1 cells （padj<0.01）. High throughput sequencing revealed a total of 2 271 differentialgenes （P<0.05）， 1 154 of which were up-regulated while 1 117 of which were down-regulated; 8 potential target genes， including p53， p21， STC2， FGF2， CDK6， CYCLIN D， PI3K， AKT， were screened by cell experiment. After validated by RT-qPCR assay， mRNA expression of  p53， p21， STC2， FGF2， CDK6， CYCLIN D and AKT were significantly down-regulated （P<0.05）， which consistent with the sequencing results. CONCLUSIONS： Genistein can effectively inhibit the growth of human nasopharyngeal carcinoma CNE1 cells， the mechanism of which may associated with inhibiting the expression of mutant gene p53， restoring the function of wild-type P53 protein and inhibiting the activity of PI3K/Akt pathway.

KEYWORDS   Genistein; Human nasopharyngeal carcinoma CNE1 cells; High throughput sequencing; Mutant gene p53; PI3K/Akt pathway

染料木素又称染料木黄酮、金雀异黄酮，分子式为C15H10O5，化学名为4′，5，7-三羟基异黄酮，为淡黄至浅褐色粉末，溶于二甲基亚砜和乙醇，是一种天然的异黄酮类化合，存在于千斤拔、淡豆豉、鸡血藤等多种天然药物中，其结构与动物雌激素雌二醇相似，故有植物雌激素之称[1-3]。现代药理研究表明，染料木素具有清除自由基、抗氧化、保护心脑血管系统、预防动脉粥样硬化、防治阿尔茨海默病等多种作用[4-7]。除此之外，染料木素还因具有显著的抗肿瘤作用而备受关注，如其对乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌、口腔癌、喉癌、甲状腺癌等多种癌症均有抑制作用[8-15]。……