汪建文，邓春英，洪 江

(贵州科学院，贵州 贵阳 550001)

0 引言

羊肚菌(Morehellaspp.)是一类稀有的腐生和菌根菌兼性真菌，属于盘菌纲(Discomycetes)羊肚菌科(Morohellaceae)羊肚菌属，具有较高的食用和药用价值。在羊肚菌人工栽培技术中有几个关键环节：菌种、外援营养袋、出菇管理。1982年，罗纳德·奥维尔(Ronald D.Ower)开展了羊肚菌人工控制下的栽培实验，采用不同营养的层级基质培养出菌核，并以菌核为种进行栽培，培育出羊肚菌子实体[1-4]，从此，菌核的形态及其功能作用引起了广泛关注。菌核被认为是羊肚菌子实体形成过程中的关键要素[5]，但其中的外援营养袋技术被忽视，文献报道大部分重复Ower的实验很难成功[6-8]。随着我国羊肚菌大田栽培的成功，突现出外援营养袋的重要作用，但对菌核的作用仍然不明，存在诸多分歧，据报道除了极少数种类的羊肚菌没有菌核外，羊肚菌属的大多数种类都会产生菌核[9-10]，但是在野生条件下又很少能发现羊肚菌菌核的存在[11]，因此，对于羊肚菌菌核作用如何，很有必要开展进一步的研究。本文通过采用Ower等人广口瓶相近的方法对两种羊肚菌进行菌核人工培养，并以其中产生较大菌核的七妹羊肚菌核为种进行栽培试验研究，探讨羊肚菌菌核功能作用，以及和外援营养的关系，为羊肚菌的菌种繁育和生产应用提供科学参考。

1 材料及方法

1.1 材料

分别采用六妹羊肚菌原种MS12和七妹羊肚菌原种C7(贵州绿鑫源农业科技发展有限公司)，用不同培养基对两种羊肚菌进行菌核生成实验，并以产生的菌核为种，进行羊肚菌栽培实验。

1.2 试验方法

用原种菌丝或培养后的菌核为种进行接种；接种广口瓶放置在阴暗室内培养菌核，湿度60%～80%，温度在12～15 ℃。

(1)以麦粒和玉米粒为主要营养物质的培养基质，用广口瓶法产生菌核，广口瓶容积为480 mL，以观察不同培养料对菌核形成的影响。

(2)以麦粒为主要营养物质的培养基质，广口瓶容积为480 mL，培养基质分别占到40%、60%、80%，其余土壤分别占到60%、40%、20%，用广口瓶法形成菌核，对比不同富营养物占比对菌核形成的影响。

(3)以麦粒为主要营养物质的培养基质和土壤50%∶50%均匀混合，用容积240 mL和480 mL的广口瓶形成菌核，以观察菌核产量及容器大小对菌核形成的影响。

(4)以方法(3)中产生的菌核为菌种，于第1年12月初，种植于30 cm×40.5 cm×7 cm的框中，菌核覆土深2 cm左右，pH7～8，土壤含水量在40%左右，气温12～16 ℃，置于室外，空气湿度保持在80%～90%。分别进行了以麦粒为主要原料的营养袋栽培方式和只用菌核而无营养袋的栽培方式的出菇对比试验。

2 结果

在菌核培养过程中，玻璃罐接种后菌丝生长迅速，在15 ℃左右的温度下7～8 d长满接种罐，在11～12 d时从罐子上部开始生成菌核。发现以麦粒和玉米粒为主要营养物质的培养基质相比，麦粒营养基质能产生更多的菌核(图1)。

在营养基质与土壤分层培养的情况下，菌核主要是在土壤层中形成，菌核密度相近，培养基质与土壤占到40%∶60%的方式中能得到更多的菌核(图2)；而用麦粒为主要营养物质的培养基质和土壤以50%∶50%均匀混合的不分层方式，整个接种罐中都产生菌核、菌核与土壤相结合，总量最多(图3)；以不同容积的罐子产生菌核的时间有差别，容积为240 mL的产生菌核的时间更早(图4)。

图2 不同比例营养物产生的菌核Fig.2 Sclerotia produced by different proportions of nutrients

图3 50%土壤与50%营养物质混合比例所产生的菌核Fig.3 Sclerotia produced by the mixture of 50%soil and 50% nutrients

图4 不同容积的培养瓶产生的菌核Fig.4 Sclerotia produced by culture bottles with different volumes

两种菌株都极易产生菌核，C7(七妹羊肚菌)形成较大的菌核，块状，形状不规则，与土壤结合，直径可达2～4 cm；C12/MS(六妹羊肚菌)形成较小的菌核，直径在0.5 cm左右，数量多，分布均匀(图5)。

图5 两种羊肚菌产生的菌核Fig.5 Sclerotia produced by two Morchella species

在土壤中栽培菌核前，在水中浸泡12～24 h，菌核吸水性不强，重量几乎不变，浸泡后或没有浸泡的菌核在湿润的空气中或埋于土壤中都很容易萌发，1～2 d就可长出菌丝。1 ℃下放置于冰箱中，1个月后取出，同样在湿润的空气中或埋于土壤中都很容易萌发。

选择产生较大菌核的C7(七妹羊肚菌)的菌核作为菌种加上外援营养袋进行盆栽实验，成功培养了子实体(图6)，生长过程与麦粒种生长过程相似。第1年12月上旬，菌核种植于30 cm×40.5 cm×7 cm的框中，菌核用量在300 mL左右，菌核覆土2 cm，菌核易萌发，5～7 d菌丝长出地面，在土壤表层放置以麦粒为主要原料的营养袋，外援营养袋的土壤层中以及与罐体接触的种植土壤中易形成菌核，随后土壤表面产生分生孢子，在土壤表层菌丝变黄后，去除营养袋，浇出菇水，第2年的2月初出现原基，之后温度保持在10～16 ℃，湿度在80%～90%，3月中旬出菇。

图6 七妹羊肚菌菌核盆栽后产生子实体Fig.6 Fruiting bodies of Morchella septimelata by pot culture

同时进行了只用菌核而不使用营养袋栽培方式的对比试验，菌核用量在600 mL左右。在菌核定植于土壤1周后(Ower专利的方法)，以及在土壤表层出现分生孢子及菌丝变黄后，浇出菇水，均未出现原基。

3 讨论

3.1 菌核的形成

真菌菌核有“真菌核”和“菌核样结构”之分，“真菌核”通常由外向内依次是外皮层、皮质层和髓质层，而“菌核样结构”的假菌核，是由密集未分化的菌丝组成，包括一些菌丝结构将土壤或树枝结合在一起，与根茎和落叶之间形成粘连，有许多真菌还将部分基质封闭在着色的厚壁细胞层内[12]。菌核通常在菌丝被切断、撕裂、紧贴着培养容器的边缘生长或与各种化学屏障(包括变质产物或特定形态发生物质)接触时引起，或在与其他微生物，挥发性或可扩散的化学物质的相互作用也可能引起菌核的发生[13]。

羊肚菌菌核被认为是未分化的假菌核。在人工设定的玻璃罐环境中培养菌核，形成了屏障作用，通常在延罐的边缘上生长更多的菌核，在小石子的周围也常发现菌核的生成，这些物理屏障的地方促使了菌核的生成。

在采用玻璃罐方式培养菌核，形成屏障作用的同时，也营造缺氧的环境，可能导致氧化应激反应，促进了菌核的形成。何培新等研究[14]，氧化应激反应也可能是诱导羊肚菌菌核发生的重要原因，氧化应激会诱导多种真菌菌核分化，通过形成菌核规避氧气，阻止超氧化状态的发展，避免对细胞产生更大的损伤，代谢中的多酚氧化酶也起着作用，使碳水化合物或菌丝表面的蛋白质发生氧化聚合反应，通过单个菌丝的交联将它们结合在一起，从而使小的菌丝聚集发展而成为菌核。

在我们的实验中，由于种的不同，C7(七妹羊肚菌)形成较大的菌核，形状不规则，块状，与土壤结合，直径可达2～4 cm；MS12(六妹羊肚菌)形成较小的菌核，直径在0.5 cm左右。两个种的菌核均很容易形成，并与土壤结合在一起，土壤中的无机盐可能促进了菌核的形成，任爱梅等在研究不同培养基对菌核形成的影响时发现[15]，培养基无机盐浓度过高会使细胞外压升高，对细胞造成一定的影响，这可能是刺激菌核形成的条件之一。在保证菌丝正常生长的情况下，培养基内无机盐浓度越高越利于菌核的形成。

以麦粒为主的基质比玉米粒为主的基质有更好的生长，并有更多的菌核生成，这可能是以玉米为主要原料的基质的玉米是玉米粗粒，在蒸过后，由于糖分的作用，很容易粘联在一起，影响透气性，从而影响了菌丝生长和菌核的形成。

层级的方式形成了营养梯度，营养菌丝体和构成营养库的菌核原基之间膨胀梯度的变化，导致有机碳水化合物的流动，也可能是引发菌核发生的原因之一[16]，在层级培养方式中，土壤层相当于是贫侧营养层，与富营养层形成营养梯度。Amir等人在1994年确定了羊肚菌菌核形成的两个基本条件，即菌丝顶端生长所需的高膨胀势和能量代谢产生的膨胀势；在对分离平板中羊肚菌菌核形成的研究中，接种于贫侧营养基的接种物向富侧营养基生长，最终主要在贫侧产生菌核，在此过程中，营养物传输方向发生了变化，即在菌落延伸过程中，营养传输朝着菌丝体的菌丝尖端，当菌丝体到达平板边缘时，由于菌核的形成，转运速度远大于营养物质的利用，菌核形成了库的作用。

在以层级方式的罐中产生的菌核，并非营养物越多就产生越多的菌核，我们观察到在40%的营养物时能产生更多的菌核，营养物太多，促进了菌丝生长，也许在40%的营养物中已足够产生菌核的营养供给。而在运用营养物与土壤50%比例混合时更易产生菌核，这也许是创造了更多的微小的层级方式。

3.2 菌核的功能和作用

在菌核科成员菌核发育过程中，菌核中发现的主要细胞质储备是糖原、蛋白质、多聚磷酸盐和脂类，大量的内源储备积累起来，这些储备连同壁和菌丝间的物质一起，被用来维持菌核在存活期间的生长消耗，并最终在萌发过程中被利用。刘伟等对梯棱羊肚菌(Morchellaimportuna)开展了从营养菌丝体阶段(VM)、初始菌核阶段(IS)和成熟菌核阶段(MS)的完整和全面的转录组研究，检测到通过基因表达聚类鉴定的差异表达基因(DEGs)主要涉及能量代谢，而碳水化合物的分解代谢主要发生在营养菌丝阶段，富含能量的物质的合成代谢是梯棱羊肚菌菌丝生长和菌核形态发生的主要事件[17]。2018年，何培新等通过透射电镜观察到菌丝和菌核细胞中有大量的脂滴，其数量在菌核细胞中多于营养菌丝并证明羊肚菌菌丝和菌核中富含能量的物质是脂类物质，脂的积累从菌核形成的第3个阶段逐渐升高[18]。

我们运用Ower的近似方法产生菌核，利用菌核作菌种，采用外援营养袋的方法，成功培育出子实体，说明菌核作为菌种，经覆土，作为一种改良的营养结构，以菌核自身的营养作养分萌发营养菌丝，通常1个星期会长出土壤层，这时土壤中的养分不足(若没有外援营养物质，菌丝长势缓慢，菌丝稀疏)，需添加外援营养物质以供菌丝生长，菌丝长入外援营养袋中，通过菌丝的转运作用，把营养物质传输到土壤层的菌丝中，在羊肚菌本身的遗传性和外界条件下达到生殖生长，出现子实体原基，在适宜的生长条件下长成子实体。

但只运用菌核作菌种按Ower专利的方法却没有成功，菌核萌发了菌丝，通过催菇方法如浇水没有触发生殖生长，这也从反面体现出了外援营养的作用，或许是外部条件没有掌握，或是菌核量不够，特别是还没有认识到羊肚菌菌核脂类积累物的利用机制，因此还有待进一步对菌核萌发后营养利用问题以及在菌丝转入生殖生长中的作用和环境条件进行深入研究。