薛毅博，孙红涛，王佳佳

驻马店市食品药品检验所药理室，河南 驻马店 463000

药品中的杂质，为无任何疗效的物质，且可能引起患者出现副作用［1］。因此，必须严格控制杂质水平，以确保药品的安全性达到人体用药的要求。根据ICH指南［2］，原料药的杂质主要分为有机杂质、无机杂质和残留溶剂三个类别，而在这三类中，遗传毒性杂质安全阈值较低，甚至在低浓度的情况下发生突变，从而可能损伤DNA［3］。Benigin等［4］归纳总结了具有遗传毒性警示结构。但目前，仅有少数文献报道了关于药品中氯代乙烷类化合物含量的检测方法。气相色谱仪电子捕获检测器是一个选择性较好、灵敏度超高的检测器，它只对含卤素、硫、磷等的物质有超强的信号，并且要检测的物质电负性越强，它的检测灵敏度也就越高［5］。SYL930［6］是一种选择性S1P1受体激动剂，由中国医学科学院药物研究所研发，由于它可以明显改善体内的外周血淋巴细胞水平，所以通常用于对类风湿性关节炎患者的治疗，但在合成SYL930的过程中很可能产生氯代乙烷类毒性杂质。因此，本研究建立了一种气相色谱电子捕获法分析方法，同时检测SYL930原料药中可能存在的1，1，2，2-四氯乙烷、1，1-二氯乙烷和1，2-二氯乙烷等3种氯代乙烷类毒性杂质，灵敏度较高，现报告如下。

1 材料

仪器：带有ECD的气相色谱仪（安捷伦科技有限公司），DB-624（30 m×0.53 mm，3.0μm）色谱柱（北京慧安清检测科技有限公司），MSA225S电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）。

药品：1，2-二氯乙烷（GCS，99.6%）、1，1，2，2-四氯乙烷（GCS，99.9%）、1，1-二氯乙烷（GCS，99.5%）；N-甲基吡咯烷酮（NMP，色谱纯，99.5%）；SYL930原料药（批号：SNT20140402，SNT20140404）。

2 方法及结果

2.1 色谱条件

色谱柱的起始柱温设置为35℃，温度持续4 min以后，以15℃/min的速度快速升到100℃，然后以20℃/min的速度升高温度到230℃，持续20 min。之后采用纯度≥99.99%的高纯氮气，柱的流速设置为4.5 mL/min，分流比设置为5∶1，立即进样，进药量为1μL。

2.2 制备溶液

2.2.1 对照品溶液的制备：精密称量1，2-二氯乙烷100 mg，放入50 m L量瓶中，之后用NMP定容并摇匀得到1，2-二氯乙烷溶液。精密称量1，1，2，2-四氯乙烷10 mg，置于100 mL量瓶中，用NMP定容并充分摇匀后将该溶液定量稀释100倍，制得1，1，2，2-四氯乙烷溶液。精密称量1，1-二氯乙烷100 mg，放到10 mL量瓶后用NMP定容，充分摇匀后制得1，1-二氯乙烷溶液。

2.2.2混合对照品溶液的制备：精密量取上述的1，2-二氯乙烷溶液、1，1-二氯乙烷溶液各1 mL，并精密量取1，1，2，2-四氯乙烷溶液5 mL，置于100 mL量瓶中，之后用NMP定容至刻度并充分摇匀制得混合对照品溶液。精密量取1 mL上述混合对照品溶液放入10 mL量瓶中，然后用NMP定容并充分摇匀后制得混合的对照品溶液。

2.2.3供试品溶液的制备：准确称量200 mg供试品倒入1 mL量瓶中，然后用适量的NMP溶液进行超声溶解处理，之后用NMP定容至刻度并充分摇匀得到供试品溶液。

2.2.4系统适用性溶液的制备：准确称量200 mg供试品放于1 mL量瓶中，精密量取0.1 mL上述混合对照品溶液后倒入到上述量瓶中，然后用NMP定容至刻度并充分摇匀后制得系统适用性溶液。

2.3 溶液稳定性的检测

取适量的上述混合对照品溶液，按照上述“2.1”项的色谱条件，每隔2 h测定一次，共测12次，即24小时，分别记录氯代乙烷类化合物各组分的峰面积，结果显示1，1，2，2-四氯乙烷、1，1-二氯乙烷、1，2-二氯乙烷的RSD值分别为1.8%，0.89%，1.6%，表明在24 h内混合对照品溶液的稳定性良好。

2.4 标准曲线

精密量取上述混合对照品溶液，按照不同比例用NMP定量稀释此溶液，制得不同浓度混合对照品溶液，然后按照“2.1”项色谱条件测定后得到3种化合物的色谱图，峰面积作为纵坐标，各化合物的浓度作为横坐标，采用线性回归分析方法，见表1。

表1 氯代乙烷类化合物的标准曲线

2.5 精密度的测定

分别精密量取上述对照品溶液适量，将每种溶液按照不同比例定量稀释成高、中、低3种不同浓度的溶液，按照“2.1”项色谱条件进行检测分析，并且每种浓度的溶液平行4份，详细记录色谱峰并用峰面积来计算精密度大小，见表2。

表2 氯代乙烷类化合物的精密度

2.6 最小检测限和最小定量限

取适量的上述混合对照品溶液，用NMP稀释得到适当浓度的溶液，以“2.1”项色谱操作标准进行进样，以信噪比（S/N）作为样品的最小检测浓度标准，以各个组分线性范围的最低浓度表示化合物的最小定量浓度。取适量的氯代乙烷类化合物溶液后定量稀释至3种化合物浓度均为定量限的15倍，得到验证溶液。准确称量供试品200 mg，放入1 mL量瓶后取适量的NMP进行超声溶解处理，加入100μL上述验证溶液，加NMP到刻度处，充分摇匀后按照“2.1”项色谱条件进行含量测定，见表3。

表3 氯代乙烷类化合物的最小检测限和最小定量限

2.7 含量的检测

精密称取200 mg供试品放到1mL量瓶中，平行实验3份，采取适量的NMP进行超声溶解处理后，再用NMP稀释至刻度并充分摇匀，按照“2.1”项色谱条件进行检测分析，详细记录色谱图，采用外标法来计算峰面积，以此来表示含量。结果发现，在原料药SYL930中未检测出含有1，1，2，2-四氯乙烷、1，1-二氯乙烷和1，2-二氯乙烷等毒性杂质。

3 讨论

本研究建立了SYL930原料药中1，1，2，2-四氯乙烷、1，1-二氯乙烷和1，2-二氯乙烷等氯代乙烷类化合物的气相色谱电子捕获法检测，优化了色谱的检测条件。

本研究采用DB-624色谱柱，因为该色谱柱峰形对称且比较窄，无拖尾现象［7］，可以实现对氯代乙烷类化合物的有效分离；本研究采用ECD检测器，因为要分离的化合物含有氯原子，在该检测器上比较灵敏。本研究采用以15℃/min升温，因为当以15℃/min升温时，氯代乙烷类化合物的各组分形成的峰形较窄，并且可以实现氯代乙烷类化合物与NMP和供试品中的杂质峰分离完全［8］；本研究对于溶液的制备，采用准确称量、精密量取的操作方法，用NMP定容至刻度，目的是使检测结果更可靠、更具有说服性；本研究采用5:1的分流比，因为进药量过大会引起色谱的污染且还会引起基线噪声的增加［9］。本研究发现1，1，2，2-四氯乙烷在2.096～42.56 ng/mL、1，1-二氯乙烷在0.1078～10.69μg/mL、1，2-二氯乙烷在0.02136～2.136μg/m L范围内，线性关系均良好，且相关系数均大于0.999；上述三种化合物的在低、中、高浓度的RSD值0.9%～4.7%，说明该方法精密度良好；1，1-二氯乙烷的最小检测浓度为27 ng/m L、最小检测限度为0.83μg/g，相比于其他两种化合物均较高，检测结果发现原料药中的3种氯代乙烷类化合物最小定量限均＜1 ppm，且信噪比＞10，符合检测基因毒性杂质的需要［10］，可十分有效地检测原料药中的各组分，从而可以检测药物的有毒杂质。

综上所述，故采用气相色谱电子捕获法、用DB-624色谱柱建立的方法检测氯代乙烷类毒性杂质专属性良好、灵敏度较高、准确度和精密度较好，值得推广应用。