魏龙吟，毛民，沙皓淳，李欣欣，常阿倩，陈冬玲，尹贻慧，张凯，焦鸣杰，陈倩，徐文婕，李飞*（.北京中医药大学 中药学院，北京 0488；.北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，北京 00079）

乳香为橄榄科植物乳香树（Boswellia carterii Birdw.）及同属植物（Boswellia bhaw-dajianaBirdw.）树皮渗出的树脂，味辛、苦、温，归心、肝、脾经，有活血定痛、消肿生肌之功效，临床上主要用于胸痹心痛、胃脘疼痛、痛经经闭、产后瘀阻、癥瘕腹痛、风湿痹痛、筋脉拘挛、跌打损伤、痈肿疮疡等[1]。以产地区分的埃塞俄比亚乳香及索马里乳香为我国常用品。

有研究从乳香中分离得到五环三萜、四环三萜、大环二萜等萜类成分以及多种挥发油类成分，其中五环三萜类化合物最具特征性，而乳香酸为其中最具代表性的药理活性成分[2]。其中11-羰基-β-乙酰乳香酸、11-羰基-β-乳香酸、α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙酰基-β-乳香酸等乳香酸类成分具有抗炎[3]、抗溃疡[4]、抗肿瘤[5]、改善记忆[6]、保护心肾[7-8]等药理作用。

现有乳香质量控制研究主要为乳香酸类成分含量测定及HPLC指纹图谱。其中大部分含量测定研究仅对11-羰基-β-乳香酸和11-羰基-β-乙酰乳香酸1～2种成分定量[9-10]，分析成分较少，或是采用UPLC-MS/MS法测定多种乳香酸含量[11]，仪器较为复杂，而现有的HPLC指纹图谱研究[12-14]存在色谱峰分离度较低或样品来源单一、共有峰数量少的问题，由此可见现有研究难以较全面、准确、简便地反映整体质量。因此，本文尝试建立乳香UPLC指纹图谱以及5种乳香酸的含量测定方法，结合化学计量学对收集到的26批乳香饮片指纹图谱进行分析，为乳香质量控制、评价提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters ACQUITY超高效液相色谱仪（UPLC）（美国沃特世科技有限公司，PDA检测器，Empower色谱工作站）；ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；SB25-12DTDN型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；BT-25S型电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；高速粉碎机（温岭市林大机械有限公司、DFT-50A）。

1.2 试药

生品饮片来源信息见表1。11-羰基-β-乙酰乳香酸（批号：ST00940120）、3-乙酰基-β-乳香酸（批号：ST79530120）、11-羰基-β-乳香酸（批号：ST80640105）、α-乳香酸（批号：ST16340105）、β-乳香酸（批号：ST80740105）对照品（上海诗丹德标准技术服务有限公司，纯度均≥98%）。

表1 26批乳香生品饮片来源信息Tab 1 Sample source informations of frankincense pieces

HPLC级乙腈（美国Fisher公司）；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；磷酸（分析纯、天津市大茂化学试剂厂）；甲醇（分析纯、北京化工厂）。

2 方法与结果

2.1 溶液配制

2.1.1 供试品溶液 取乳香样品，粉碎（过4号筛），精密称定0.1 g，加入甲醇20 mL，称重，超声处理30 min后（功率 500 W，频率 40 kHz），甲醇补重，取续滤液过0.22 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.1.2 对照品溶液 取11-羰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸、α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙酰基-β-乳香酸对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成质量浓度为0.606、0.606、0.642、0.650、0.848 mg·mL－1的混合对照品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）。以0.1%磷酸水为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～4 min，60%B；4～5 min，60%～70%B；5～35 min，70%B；35～60 min，70%～100%B。流 速0.3 mL·min－1，检测波长210 nm，柱温30℃，进样量5 μL。

2.3 乳香指纹图谱建立

2.3.1 精密度试验 按“2.1.1”项下方法制备乳香（S7）供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。将图谱导入 “中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”进行分析，相似度均大于0.99。以6号峰的保留时间及峰面积为参照，计算得到其他各共有峰相对保留时间及峰面积RSD均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 按“2.1.1”项下方法制备乳香（S7）供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件于0、2、4、8、12、24 h进样，记录色谱图。将图谱导入 “中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”进行分析，相似度均大于0.95。以6号峰为参照，计算得其他各共有峰的保留时间和峰面积的RSD均小于3%，表明样品在室温下放置24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验 精密称取乳香（S7）样品粉末6份，每份0.1 g，按“2.1.1”项下样品制备方法平行制备6份，按“2.2”项下色谱条件分别进样，记录色谱图。将图谱导入 “中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”进行分析，得到相似度均大于0.95，以6号峰为参照，计算得其他各共有峰的保留时间和峰面积的RSD均小于3%，表明本方法重复性良好。

2.3.4 乳香指纹图谱的建立 取各批次乳香样品，按“2.1.1”项下方法制备样品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样检测，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”进行分析，以 S7样品为参照图谱，使用平均数法结合多点校正进行匹配，时间窗宽度为0.1 min，得到叠加指纹图谱（如图1）及对照图谱（如图2A）。

图1 26批乳香样品UPLC叠加图谱（S1～S26）及对照图谱（R）Fig 1 UPLC fingerprints of 26 batches of frankincense（S1～S26）and reference fingerprints（R）

共确定出24个共有峰，通过与混合对照品色谱图（见图2B）的比对，确认了5个乳香酸成分色谱峰，且分离度良好。

图2 乳香对照指纹图谱（A）和混合对照品（B）的UPLC色谱图Fig 2 Frankincense referential fingerprint（A）and mixed reference of UPLC（B）

2.3.5 指纹图谱相似度评价 根据“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”得出的26批乳香样品与对照指纹图谱相似度结果见表2。由表2可知，26批乳香样品与对照指纹图谱（R）相比较，相似度结果在0.762～0.989，其中23批乳香指纹图谱相似度大于0.89，占总批次的88.46%，1批乳香相似度低于0.80，占总批次的3.85%，表明大部分批次乳香样品相似度差异较小。

表2 26批乳香样品指纹图谱相似度评价结果Tab 2 UPLC fingerprints similarity of 26 batches of frankincense

2.4 化学计量学分析

2.4.1 聚类分析 以乳香样品指纹图谱的24个共有峰的峰面积为变量，导入SAS 9.2软件，采用离均差平方和法对样品进行聚类分析，结果见图3。当分类距离为8.5时，26批样品可聚为3类，其中第一类编号为S1、S7～S12、S19的8个批次，第二类为编号S2～S5、S14～S16、S18、S22～S25的12个批次，第三类为编号S6、S13、S17、S20、S21、S26的6个批次，说明不同批次的乳香样品整体质量存在一定差异性。

图3 26批次乳香聚类分析结果Fig 3 Dendrogram of 26 batches of frankincense

2.4.2 主成分分析 将26批乳香样品指纹图谱的24个共有峰峰面积导入SIMCA-P14.1软件进行因子分析，结果见表3，共提取到5个主成分，其中前四个主成分的累计方差贡献率为85.21%，特征值大于1，说明选取4个主成分即可表征乳香指纹图谱的85%以上的信息，可用于评价乳香质量。

表3 乳香样品主成分分析特征值及方差贡献率Tab 3 Characteristic values of principal components and variance contribution rate of frankincense

通过选取的4个主成分绘制主成分得分图（见图4A），得到聚类分析中第一类主要位于右上象限，第二类主要位于中部，第三类主要位于右下象限，说明24批次主成分分析结果与聚类分析结果相似，其中S14、S16批次可能由于主成分未包含全部信息从而与聚类分析结果存在差异。

将得到的成分矩阵进行正交旋转，得到主成分因子旋转载荷矩阵表，见表4。以载荷值的绝对值＞0.6记录，得到色谱峰3、7～9、11、13、16（α-乳香酸）、18～20、23、24（3-乙酰基-β-乳香酸）在主成分1上有较高载荷，色谱峰5（11-羟基-β-乳香酸）、6、10、12（11-羰基-β-乙酰乳香酸）、14、15、16（α-乳香酸）、17（β-乳香酸）、24（3-乙酰基-β-乳香酸）在主成分2上有较高载荷，色谱峰1、22在主成分3上有较高载荷，表明了这些色谱峰所代表成分的含量与主成分较高的相关程度。

表4 主成分因子旋转载荷矩阵表Tab 4 Composition matrix of principal component factors

以4个主成分 M1、M2、M3、M4作为乳香质量信息表征载体，将24个共有峰峰面积进行标准化处理，并在主成分的线性表达式中进行向量运算，将计算结果与主成分的方差贡献率加权，得到乳香质量评价表达式：M＝47.92% M1＋35.64% M2＋11.16% M3＋5.29% M4，最终计算后得到的综合评分结果见表5。聚类分析第一类中的 S19、S10、S12、S11、S1的5个批次综合评分排序前五，S7、S9、S8综合评分排序在7、9、11位，排序均较高，表明聚类中的第一类，同时主成分分析位于右上象限的乳香整体质量较好。

表5 26批次乳香主成分得分、综合得分及排名Tab 5 Principal component score，comprehensive score，ranking of 26 batches of frankincense

2.4.3 偏最小二乘判别分析 将主成分分析得分图进行监督模式识别方法偏最小二乘判别建模分析，得到相应得分图（见图4B），并采用变量重要投影（VIP）法筛选出影响乳香批次间差异的主要成分，结果见图5。以VIP值＞1.0为标准，可筛选出对乳香质量有关键性影响的10个成分，按影响大小排序分别为5（11-羰基-β-乳香酸）、2、8、12（11-羰基-β-乙酰乳香酸）、15、6、10、4、24、17（β-乳香酸）号色谱峰对应成分。

图4 26批乳香样品主成分分析（A）及偏最小二乘判别分析（B）得分图Fig 4 PCA（A）and PLS-DA（B）score diagrams of 26 batches of frankincense

图5 偏最小二乘判别分析VIP值图Fig 5 VIP of PLS-DA

2.5 5种乳香酸类成分含量测定

2.5.1 线性关系考察 精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液，稀释成系列线性溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，进行线性回归，结果见表6。

表6 5种乳香酸类成分线性关系Tab 6 Linear relationships of 5 kinds of boswellic acids

2.5.2 精密度试验 取乳香（S7）供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，记录11-羰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸、α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙酰基-β-乳香酸的峰面积，计算RSD分别为0.34%、0.54%、0.26%、0.28%、0.57%，均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性试验 精密称取乳香（S7）样品粉末6份，每份0.1 g，按“2.1.1”项下样品制备方法平行制备6次，按“2.2”项下色谱条件进样测定，结果11-羰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸、α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙酰基-β-乳香酸的峰面积，计算RSD分别为2.5%、1.6%、0.95%、2.0%、0.78%，均小于3%，表明本方法重复性良好。

2.5.4 稳定性试验 取乳香（S7）供试品溶液按“2.2”项下色谱条件于0、2、4、8、12、24 h进样测定，结果11-羰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸、α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙酰基-β-乳香酸的RSD值分别为0.42%、0.17%、1.3%、1.9%、0.28%，RSD值均小于3%，说明样品在室温下放置24 h内稳定性良好。

2.5.5 加样回收试验 取已知含量乳香（S7）样品粉末6份，每份0.05 g，分别精密加入适量对照品，按“2.1.1”项下方法制备，进样测定，计算11-羰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸、α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙酰基-β-乳香酸的平均加样回收率依次为96.37%、97.86%、98.99%、100.57%、99.51%，RSD值分别为1.2%、2.7%、2.0%、2.1%、2.8%，表明该方法回收率良好。

2.5.6 含量测定结果 取各批次乳香样品，按“2.1.1”项下方法制备样品溶液，在“2.2”项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录对应色谱峰的峰面积，计算5种乳香酸含量，结果见表7。

表7 26批次乳香中5种乳香酸类成分含量测定结果(%，n＝3)Tab 7 Results of content determination of 5 kinds of boswellic acids in 26 batches of frankincense (%，n＝3)

3 讨论

试验前期对色谱条件进行了考察，考察了4种不同流动相系统（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸水、乙腈-磷酸水），结果显示乙腈-磷酸水系统效果最优，进一步对磷酸水酸度（0.05%磷酸、0.2%磷酸、0.5%磷酸）、不同的柱温（35、40℃）、不同进样量（2、4、6、8 μL）、不同检测波长（254、270、280 nm）进行考察，最终确定了本试验的色谱条件，所得到的色谱图基线平稳，色谱峰信息较多。

26批乳香样品的相似度为0.762～0.989，聚类分为3类，显示出乳香样品存在的质量差异性，表明对乳香质量进行控制的必要性；而同来源、同产地的13批北京同仁堂乳香样品的相似度在0.904～0.989，批次间差异小，质量稳定，提示选择同来源、同产地的乳香对用药过程稳定性、临床疗效有一定帮助。

在明确质量差异贡献较大的指标性成分时，确定了对乳香质量有较大影响的10个色谱峰成分，通过对照品的指认，仅可确定其中3种成分，后续可结合液质联用技术，对未知的7个色谱峰成分进行定性定量研究，以更准确、全面地控制乳香的质量。

本研究建立了乳香中5种乳香酸类成分的含量测定方法及乳香的UPLC指纹图谱，结合HCA、PCA及PLS-DA，形成了乳香品质评价的化学识别模型，并可筛选出影响质量的关键性成分。该方法可更简便、准确、全面地评价乳香质量，为完善乳香质量评价体系提供一定参考。