戴国英 刘慧慧 马丹 于化新 单德红

【摘要】 目的：觀察50%限食（dietary restriction，DR）14 d对大鼠海马神经元线粒体的结构和功能及其自噬的影响，探讨DR的安全性。方法：选取16只雄性SD大鼠按体质量配对分为正常组和DR组，每组8只。正常组给予自由进食，DR组给予50%DR，14 d后取海马组织，透射电镜观察海马神经元线粒体超微结构，JC-1法检测线粒体膜电位（ΔΨm），ELISA法检测线粒体ATP和反应性氧簇（reactive oxygen species，ROS）水平，Western blot法检测微管相关蛋白轻链3（light chain 3，LC3）-Ⅰ和Ⅱ表达并计算两者比值。结果：两组线粒体均边缘清楚，但正常组相对较大，嵴呈片状，数量较多，而DR组的线粒体较小，且存在嵴减少现象;与正常组比较，ΔΨm和ATP水平均下降（P<0.05），但ROS水平变化不明显（P>0.05），LC3-Ⅱ表达上升，LC3-Ⅰ表达下降，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高。结论：海马神经元线粒体可被14 d的50%DR负性影响，但可通过增强线粒体自噬进行对抗。

【关键词】 饮食限制 海马 神经元 线粒体自噬 微管相关蛋白轻链3

Effect of Diet Restriction on Mitophagy in Hippocampal Neuron of Rats/DAI Gouying， LIU Huihui， MA Dan， YU Huaxin， SHAN Dehong. //Medical Innovation of China， 2021， 18（13）： 0-031

[Abstract] Objective： To observe the effects of 50% dietary restriction （DR） on the structure and function of hippocampal neuron mitochondria and mitophagy of rats for 14 d， and to explore the safety of DR. Method： A total of 16 male SD rats were selected and divided into normal group and DR group according to body weight， with 8 rats in each group. The normal group was given free food， and the DR group was given 50%DR. After 14 days， the hippocampal tissue was taken， and the mitochondrial ultrastructure of the hippocampal neurons was observed by transmission electron microscopy. The mitochondrial membrane potential （ΔΨm） was detected by JC-1 method. Mitochondrial ATP and reactive oxygen species （ROS） levels were detected by ELISA， and microtubule-associated protein light chain 3 （LC3）-Ⅰ and Ⅱ expression were detected by Western blot， and their ratio was calculated. Result： Mitochondria in both groups had clear margins， but the normal group was relatively large with flaky cristae and more number， while the DR group had smaller mitochondria with reduced cristae; compared with the normal group， the levels of ΔΨM and ATP were decreased （P<0.05）， but the ROS level was not significantly changed （P>0.05）， the expression of LC3-Ⅱ was increased， the expression of LC3-Ⅰ was decreased， and the ratio of LC3-Ⅱ/Ⅰ was increased. Conclusion： Hippocampal neuronal mitochondria might be negatively affect by 14 d 50%DR， but it can be opposited by increasing mitophagy.

[Key words] Dietary restriction Hippocampus Neuron Mitophagy Microtubule-associated protein light chain 3

First-authors address： College of Integrated Traditional Chinese Medicine and Western Medicine， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 110847， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.13.007

研究显示，多食已成为众多疾病的新的病因，而饮食限制（dietary restriction，DR）也成为新的治疗手段[1-2]。DR对神经系统退行性病变、糖尿病、心血管疾病和癌症等治疗具有一定作用，其机制与保护线粒体和抗氧化等有关[3-5]。DR的本质是暂时减少细胞的营养供给，而线粒体对营养信号极为敏感，其结构、功能和胞内分布会随之发生变化，称为线粒体可塑性[6]。线粒体是多功能网状细胞器，其损伤不仅减少细胞供能，还会干扰胞内钙稳态和生物合成，甚至诱发氧化应激和免疫异常，从而参与众多疾病的发生发展[7-8]。因此，如何在开展DR的同时，尽量减少其对线粒体的影响至关重要。DR方案较多，其限食程度和持续时间不尽相同[2，4，9-11]。本研究设计了相对激进的14 d的50%DR方案，观察其对正常大鼠海马神经元线粒体结构、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）水平和线粒体自噬流的影响，旨在探讨DR的安全性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 16只SPF级雄性SD大鼠，体质量（200±10）g，购于辽宁省本溪巿实验动物中心，适应性饲养（室温18～23 ℃，相对湿度45%～55%）1周后开始实验。

1.1.2 主要试剂和抗体 线粒体提取试剂盒（北京索莱宝生物技术有限公司，批号：20170824），JC-1线粒体膜电位（ΔΨm）检测试剂盒（北京索莱宝生物技术有限公司，批号：20171102），ATP检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20171107），反应性氧簇（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒（Tsz Biosciences，批号：201710）;山羊抗兔多克隆抗体微管相关蛋白轻链3 （microtubule-associated protein light chain 3，LC3）-Ⅰ和Ⅱ （Proteintech， 批号：00010203;00023353）、GADPH（Transgen Biotech，批号：L10515）;

兔抗鼠二抗（Proteintech，批號：200000002），EasySee Western blot发光液（北京全式金生物技术有限公，批号：10419）。

1.1.3 主要仪器 JEM-1011透射电镜（日本电子），iMark酶标仪、转膜仪和电泳仪（均美国Bio-Rad），高速冷冻离心机（美国，Thermo Sientific，ST-16R）、显影仪（上海天能科技有限公司，Tanon5200）。

1.2 方法

1.2.1 分组和DR方法 将大鼠按体质量配对分为正常组和DR组，每组8只，均单笼饲养。从实验的第0天开始，精确称量每只正常组大鼠的单日进食量，减半为下一天配对DR组大鼠的喂食量。DR持续14 d，实验结束时没有大鼠死亡及脱失现象发生。该实验项目已通过辽宁中医药大学实验动物伦理委员会的审核（20151205）。

1.2.2 标本采集 大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉后，断头取双侧海马组织，部分于4 ℃下切成约1 mm的3小块，2.5%戊二醛固定，用于线粒体超微结构观察;部分置于线粒体蛋白分离缓冲液中，制备海马组织匀浆后离心（1 000 g，

5 min，4 ℃），取上清同条件再次离心，再取上清离心（1 200 g，10 min，4 ℃）后，吸取沉淀加入100 μL PBS（pH 7.4），制取线粒体悬液备用;海马其余部分于-80 ℃冻存，用于Western blot检测。

1.2.3 线粒体超微结构观察 参考文献[12-14]方法，将上法固定的组织用PBS漂洗，1%锇酸固定后，乙醇和丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋切片（50～60 nm厚），3%醋酸铀-枸橼酸铅双染，120 kV拍片观察海马神经元线粒体超微结构。

1.2.4 线粒体OXPHOS评价 取海马神经元线粒体悬液，按文献[12-14]方法，JC-1法检测ΔΨm，ELISA法分别检测ATP和ROS水平，均严格按照说明书操作。

1.2.5 线粒体自噬水平评价 采用Western blot检测LC3-Ⅰ和Ⅱ表达，并计算两者比值。依据文献[9-11]方法，取冻存海马组织，室温解冻后加入线粒体蛋白质裂解液，静置30 min，冰上研磨后置于EP管中，离心（1 000 g，10 min，4 ℃）取上清，BCA法测定蛋白浓度;每管加入6×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液100 μL，100 ℃变性，按50 μg总蛋白上样量计算加样体积，SDS-PAGE凝胶电泳后转膜和切膜，37 ℃水浴5%脱脂奶粉/TBST封闭1 h，分别加入LC3-Ⅰ（1︰200）、LC3-Ⅱ（1︰1 000）和GAPDH（1︰2 000）各4 mL，4 ℃摇床过夜，TBST洗膜，加入4 mL HRP标记的山羊抗兔二抗（1︰5 000），GAPDH加入4 mL HRP标记二抗（1︰

2 000），37 ℃震荡孵育1 h，TBST洗膜，加入ECL发光液，曝光显影。应用AlphaView SA软件计算蛋白表达量，为方便制图，结果以DR组相当于正常组的百分比表示。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 线粒体超微结构观察 两组线粒体均边缘清楚，但正常组相对较大，嵴呈片状，数量较多，而DR组的线粒体较小，且存在嵴减少现象。见图1。

2.2 两组线粒体OXPHOS水平比较 与正常组比较，DR组的ΔΨm和ATP水平下降，均有统计学意义（P<0.05），但ROS水平变化不明显，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.3 两组线粒体自噬流评价 DR组LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的相对表达量分别为正常组的（80.54±6.89）%与（151.44±32.16）%，DR组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值为正常组的（190.34±50.18）%。见图2。

3 讨论

海马是边缘系统的重要结构，不仅在情绪、认知、行为和学习记忆等方面发挥重要作用，还能够调节心血管、消化吸收等内脏活动，而其损伤与老年痴呆、帕金森病等的发生发展密切关联[15]。中枢神经元能量消耗巨大，其中约44%用于突触传递，25%消耗在细胞骨架运动、大分子合成和细胞器间联络，16%花费在细胞放电，15%用来维持膜电位[16-17]。线粒体是细胞动力工厂，为细胞提供95%以上的能量，其健康对于细胞至关重要。

DR的本质是暂时减少细胞的营养供给，这势必干扰线粒体。本研究从形态和功能等方面观察了14 d的50%DR对海马神经元线粒体的影响，结果显示，DR组线粒体变小且部分线粒体嵴减少，ΔΨm和ATP水平降低，但ROS變化不明显。ATP、ΔΨm和ROS均为线粒体OXPHOS的反应产物，前两者减少显示14 d的50%DR影响了海马神经元线粒体产能，而后者变化不大则提示ROS没有过度合成，即发生氧化应激的可能性不大。尽管如此，功能异常的线粒体个体如不及时清除，线粒体网络终将受损，进而在多方面干扰细胞功能。

研究发现，ΔΨm下降可以激活线粒体自噬机制，从而维护线粒体网络健康[18]。线粒体自噬过程复杂，主要是去极化的线粒体被吞噬泡包裹形成自噬体，再进入溶酶体内被分解[19]。线粒体自噬环节较多，受众多自噬相关蛋白调控，因此相关蛋白表达水平常可以反映自噬程度，其中较为常用的是LC3。LC3对于吞噬泡的延伸和自噬体的形成等极为重要，其前体先被分解为LC3-Ⅰ后，再被脂化为LC3-Ⅱ[20]。因为LC3-Ⅱ位于吞噬泡膜上和自噬体的内膜和外膜，所以其表达可以反映吞噬泡、自噬体和自噬相关结构的数量，是最为常用的自噬流标志物[21]。本研究结果显示，DR组的LC3-Ⅱ表达上升，LC3-Ⅰ表达下降，且LC3-Ⅱ/Ⅰ比值上升，说明14 d的50%DR可提高LC3-Ⅱ表达，从而加快吞噬泡的发育，促进自噬体及相关结构的生成，从而有利于清除异常线粒体个体。

综上所述，海马神经元线粒体可被14 d的50%DR负性影响，但可通过线粒体自噬进行对抗。不过线粒体自噬水平上升会减少线粒体数量，因此开展DR需注意其时间和强度，防止线粒体网络受损。

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（收稿日期：2020-07-29） （本文編辑：田婧）