王 琼,陈文怡

(云南省文山州林业和草原资源监测站,云南 文山 663000)

1 引言

蒜头果是云南、广西的特有树种，种子富含油脂，是制作润滑油的重要原料，木材经加工后可做家具、船舶，经济价值较高。此外，作为一种高大、挺拔的常绿乔木，也常用作城市绿化，发挥生态效益。作为国家二级保护植物，由于生长环境遭到破坏、不合理的开采利用等，导致蒜头果数量锐减、接近濒危。除了采取建立自然保护区、严防滥砍滥伐等保护措施外，积极采种育苗、扩大种植面积也是一种可行性保护措施。其中，组织培养是繁育蒜头果的一种常见方式，但是在组培过程中容易出现褐化现象，导致植体死亡、培养失败。因此，探析蒜头果组培褐化原因和控制措施，对蒜头果的保护与繁育有重要的意义。

2 材料与方法

2.1 试验用材

本次试验所用蒜头果外植体均来自于云南省文山州某苗圃繁育基地，苗高1.3～1.8 m，树苗笔直、挺拔，外表无明显表皮破损或其他机械损伤，无虫蛀或病害等情况。

2.2 试验方法

对外植体进行去叶处理，从叶柄部位剪断，去除叶片。然后选择当年春季发出的新梢，从中间部位截取15 cm。然后再将截取下来的新梢分成3段，分别是茎梢、幼嫩和半木质化3种类型。保证每种类型的枝条上均含有3～5个不等的饱满腋芽[1]。将所有材料收集起来，使用清洁的水流动冲洗，持续45 min。选取一个较大的容器，加入适量洗洁精，按照1∶300比例兑水，把流水冲洗后的材料放入容器中，浸泡10min。浸泡期间每隔1 min进行一次摇晃，保证材料各处均得到清洗。将材料捞出后置于超净台上，平铺开来，使用去离子水进行第二次冲洗，最后使用干净滤纸覆盖在材料表面，将水分吸干[2]。完成上述处理的每段材料，使用小刀斜向切开，一分为二，形成两个大小相同的材料，放置到培养基中。最后得到30瓶含有接种茎段的试验材料，将其置于(25±1)℃的恒温环境下，每天提供光照2400～3200 lx，光照时间为8 h/d。按照此法连续培养1周，每天记录一次外植体褐化情况[3]。其中：

褐化率=褐化株数/接种总数×100%；

获得率=未污染未褐化株数/接种总数×100%。

2.3 正交试验设计

首先，为了防止外植体裁切后出现感染进而干扰试验结果的情况，需要做严格消除处理[4]。本次试验中，根据外植体类型的不同，分别提供了3种消毒处理:①对于茎梢，选择0.3%氯化汞浸泡，持续约5 min；②对于幼嫩，用2%的次氯酸钠浸泡10 min；③对于半木质化，先使用75%酒精浸泡60 s后，替换为氯化汞与次氯酸钠混合液处理6 min[5]。具体情况见表1。

表1 三种外植体的消毒处理方式

外植体的处理方式如上文所述，抗氧化剂也要根据外植体类型来选用，茎梢部分使用聚乙烯吡咯烷酮，用量按照5 g/L，幼嫩部分使用硫代硫酸钠，用量按照500 mg/L，半木质化部分使用抗坏血酸，用量为160 mg/L[5]。茎梢和幼嫩的培养基要做高温高压杀菌处理，半木质化培养基仅做过滤除菌处理。3种类型的外植体对应的培养基分别是1/2WPM，1/2MS和1/2DKW。其成分为4.5 mg/L的6-苄基腺嘌呤，0.2 mg/L的萘乙酸，10 g/L的琼脂，50 g/L的糖，以及3 g/L的活性炭[6]。培养基呈弱酸性。

3 结果与分析

3.1 正交试验结果及其分析

正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果

结合表2可以发现，极差(R)的值从大到小排序依次是B>C>A>D，再结合“褐化率”一栏的数据，可知对蒜头果外植体褐化影响最大的是外植体的类型，其次是试验中所选抗氧化剂的类型，而培养基的类型影响最弱。4种影响因素的最优组合为A3B3C1D1，即选用半木质化外植体，对其进行氯化汞+次氯酸钠联合消毒后，放置于加入了聚乙烯吡咯烷酮的1/2WPM培养基上，能够将褐化率降到最低[7]。

在参考极差(R)排序的基础上，结合“获得率”一栏的数据，可知对蒜头果无菌苗获得率影响最大的仍然是外植体的类型，但是4种影响因素的最优组合变成了A1B1C3D1，即选用茎梢作为外植体，使用0.3氯化汞材料进行消毒处理，然后将其放置于加入了抗坏血酸的1/2WPM培养基中，经过组织培养可以使蒜头果无菌苗的获得率最高[8]。

3.2 方差结果及其分析

蒜头果褐化率、获得率的方差分析结果见表3。

表3 褐化率、获得率方差分析

结合表3可知，“褐化率”一项中，影响因素B的F值达到了50.8，明显超出了其他3个影响因素，说明外植体的种类是对蒜头果褐化率影响最大，这与上文的正交试验结果具有一致性。除此之外，从差异性显著分析结果来看，在“外植体类型(B)”一项中，不同类型外植体的褐化率也存在较大差距，茎梢(1)的褐化率最高，达到了79.6%，而半木质化(3)的褐化率仅有22.5%。在其他3个因素中，虽然采用不同的消毒方式、选择不同的抗氧化剂，也会对褐化率产生影响，但是差异并不显著。由此可知，选择半木质化枝条能够使蒜头果的褐化率降低[9]。

4 讨论

组织培养是植物繁育的一种常用方法，而褐化现象则是组培过程中较为常见的一种情况，是导致培养失败的主要因素。现阶段，抑制褐化的方式方法有多种，例如挑选外植体、加强消毒处理、使用生长调节剂，或者是在培养基中加入抗氧化剂等[10]。在组织培养蒜头果时，本文分别选取了外植体类型、消毒处理、抗氧化剂、培养基这4个影响因素进行了探究分析。试验结果表明，外植体类型对蒜头果褐化率影响最为明显，以半木质化枝条作为外植体，使用氯化汞与次氯酸钠混合液处理6min进行消毒，然后将其放置到加入了聚乙烯吡咯烷酮抗氧化剂的1/2WPM培养基上，可以使褐化率控制在最低水平。除此之外，试验过程中光照、温度等环节因素的影响，也会对蒜头果褐化现象产生影响。在试验过程中还要对试验环境加以控制，尽量保证环境的一致性，消除无关变量影响，对保证试验结果的可靠性有一定帮助。