孔维丽 郭家稳 刘芹 齐曼 崔筱 李亚楠 高玉千 邱立友 张玉亭

摘 要：為建立平菇培养料发酵度的判定指标，选用以粉碎玉米芯小粒、中粒和大粒为主要原料配制的平菇培养料，分析了发酵过程中含水量、pH值和总碳、总氮、水溶性有机碳（DOC）、氨含量以及杂菌抑制物质含量的变化，以及栽培平菇的生产特性。结果表明，发酵过程中，3种培养料的pH值先降后升，含水量、总碳含量、C/N和DOC含量降低，氨含量先升后降，总氮升高。发酵结束，小粒DOC含量低于大粒，而氨含量和杂菌抑制物质含量高于大粒。培养料粒径越小，栽培平菇发菌期料温越低、染菌率越低、生物学效率越高。因此，发酵料栽培平菇宜采用小粒的粉碎玉米芯，发酵结束发酵料含水量为60%～67%、pH值为8.0～8.6、DOC（w）以低于12 g·kg-1和氨含量（ρ）为发酵料渗出液中以氨检测试纸条测定值低于1 350 mg·L-1为宜。

关键词：平菇;发酵料;发酵度;水溶性有机碳;氨含量

中图分类号：S646.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）02-054-007

Establishment of the fast determination index for the compost degree of oyster mushroom substrate

KONG Weili1， GUO Jiawen2， LIU Qin1， QI Man2， CUI Xiao1， LI Yanan2， GAO Yuqian2， QIU Liyou2， ZHANG Yuting1

（1. Institute of Plant Nutrition， Agricultural Resources and Environmental Science， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. College of Sciences， Henan Agricultural University， Zhengzhou， 450002， China）

Abstract： To establish an index system for determining the compost degree of the oyster mushroom（Pleurotus ostreatus）composted substrate， the water content， pH value， total carbon， total nitrogen， water-soluble organic carbon（DOC）， ammonia content and the content of harmful microorganisms inhibiting substances of the oyster mushroom substrate prepared with the small， medium and large particles of the crushed corncob as the main raw materials were we analyzed during composting process. Furthermore， the production characteristics of the composted substrates were determined. During the composting process， the water content， total carbon and C/N of the three substrates gradually decreased， the pH value earlier decreased rapidly and then increased slightly， while the ammonia content earlier increased fast and then decreased markedly， the total nitrogen of the medium and large particles substrates earlier remained unchanged and then increased， whereas the small particles substrate kept increasing. The results of ammonia contents by ammonia test strip method and ammonia test kit method were significantly correlated. At the end of compost， the DOC content in the small particles substrate was significantly lower than that of the large particles substrate， but the ammonia content and the content of harmful microorganisms inhibiting substances in the small particles substrate were significantly higher than those of the large particles substrate. The smaller the particle sizes of the substrates， the lower the substrate temperature during the mushroom mycelia growth period， the lower the infection rate and the higher the biological efficiency. Therefore， it is advisable to use small crushed corn cobs to cultivate oyster mushrooms with composted substrates. The water content of the composted substrates is 60%-67%， the pH value is 8.0-8.6， and the DOC （w） should be less than 12 g·kg-1 （ρ） and ammonia content in the compost exudate should be less than 1 350 mg.L-1 at the end of the composting process.

Key words： Pleurotus ostreatus; Composted substrate; Compost degree; Soluble organic carbon; Ammonia content

平菇是深受消费者喜爱的食用菌，栽培技术简便、生产周期短、产量高，是利用农业废弃物生产食物的优良食用菌种类，目前在我国和世界食用菌总产量中排第3位。然而，平菇和其他食用菌培养料灭菌燃煤造成的空气污染与清洁空气环保要求的矛盾日益突出，影响了平菇和其他食用菌的可持续健康发展。为适应新的形势，平菇发酵料栽培新技术越来越受到重视[1-2]。

平菇发酵料栽培新技术即是将平菇培养料先进行堆制高温发酵，杀死培养料中不耐高温的病原菌和虫卵等。微生物分泌的木质纤维素降解酶、蛋白酶和淀粉酶等，降解培养料中高分子物质，提高培养料的可利用性，并合成杂菌抑制物质等[3-4]。发酵料栽培平菇与灭菌熟料栽培平菇相比，其优势除可减少能耗降低成本外，还可开放接种，染菌率低，发酵后的原料易于利用，再加上发菌期袋温比气温高10℃左右，因而发菌速度快，产量和质量与熟料相当，是一项简捷、高效、速生、高产的栽培技术，在全国迅速推广应用[5-6]。

然而，平菇发酵料栽培新技术在我国推广应用过程中也出现许多问题，如平菇发菌期料温高导致烧菌、氨浓度高抑制平菇发菌和染菌率高等。与双孢蘑菇培养料和国外平菇培养料二次发酵工艺相比，我国平菇培养料发酵工艺相当于仅进行了第1次发酵，未经第2次发酵，发酵料中残留的水溶性有机碳（Dissolved organic carbon，DOC）、氨含量高和有益菌没有取得优势，可能是我国发酵料栽培平菇发菌期料温高导致烧菌、氨浓度高抑制平菇发菌和染菌率高的原因。DOC含量与堆肥的初20 h氧气需求量（Oxygen demand for the first 20 h，OD20）呈显著正相关[7]。因此，平菇发酵料发酵度指标对发酵料栽培平菇高产稳产非常重要，判定指标除含水量、pH值、C/N、气味和颜色等[8]外，还应增加DOC和氨含量指标。

影响固态发酵的因素包括温度、供氧量 、含水量、pH值、C/N比、粒径、压实度和发酵周期等[9]。原料粒径对固态发酵影响较大，粒径过大，原料持水量低，孔隙度大，发酵过程中会导致通风过度，料温升温慢，高温持续时间短;粒径过小，会使原料持水量过高，孔隙度小，通氧量不足，同样会导致升温慢，高温持续时间短，原料发酵不充分[10-11]。但粒径对平菇培养料发酵质量的影响尚未见报道。

笔者选择3种不同中值粒径的粉碎玉米芯为主要原料配制的平菇培养料，测定了发酵过程中含水量、温度、pH、DOC和氨含量等指标，以期建立平菇发酵料发酵度快速测定指标。

1 材料与方法

1.1 平菇培养料

配方是玉米芯84%、麸皮10%、尿素1%、石灰5%，料水质量比1∶2.5。粉碎玉米芯过不同目筛，中值粒径分别为小粒0.5 mm、中粒0.9 mm和大粒1.5 mm，以此3种粒径的粉碎玉米芯配制成3种培养料进行发酵。

1.2 培养料发酵

按照配方将原辅材料混合均匀，加水拌料，培养料含水量控制在65%～70%，pH值9～10。于2019年10月上旬在河南省农业科学院原阳现代农业科技试验示范基地开始建堆，建堆为截面呈梯形，堆高100 cm，底宽2.0 m，顶宽1.5 m。用直径8 cm的木棒在料堆上部、横竖间隔40～50 cm打通风孔，通风孔呈“品”字形。雨天搭盖遮阳物，严防雨水大量渗入料堆。

建堆后温度上升至45～55 ℃，进行第1次翻堆。翻堆要均匀，重新建堆，料面打孔。料温上升至70 ℃以上，保持24 h，进行第2次翻堆，翻堆过程有利于氨等异味散出及新鲜空气交换，翻堆后重新建堆，料面打孔。料温再次上升至70 ℃以上，保持24 h，进行第3次翻堆。

培养料高温降至68 ℃以下，培养料发酵趋于成熟，进行第4次翻堆，维持24 h。料堆截面出现大量白色菌丝，此时培养料颜色进一步加深，为深褐色，无酸臭味，手握培养料软且松散，此时培养料含水量为60%左右，pH值降至7.5～8.0。发酵结束，培养料摊平降温，料温降到35 ℃以下即可进行装袋栽培。

于建堆后、每次翻堆后和发酵结束取发酵料，按四分法取样。新鲜样及时用于分析。

1.3 平菇栽培

培养料发酵结束，于2019年10月中旬在河南省农业科学院原阳现代农业科技试验示范基地开始接种平菇‘黑平17-1进行培养，常规管理。‘黑平17-1是河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所选育的平菇新品种，于2017年通过省级鉴定。采用26 cm×51 cm×0.001 5 cm聚乙烯袋栽培，按照两端两层中间两层的接种方法开放接种，接种量15%，接完种的菌袋两端用直径1 cm的木棒各打2个通风孔，移入大棚内培养，菌袋摆放5层，棚内温度10～20 ℃，通风良好，每个处理3组，每组30袋，随机区组排放。测定栽培袋发菌温度、菌丝生长速度、生长势、染菌率、满袋时间、出菇时间和菇鲜质量。

1.4 測定项目和方法

料温测定采用直杆接触式温度测定仪。采用C、N元素分析仪测定总碳（Total carbon，TC）和总氮（Total nitrogen，TN）含量。发酵料浸提液的制备方法是，取10 g样品加100 mL蒸馏水，在室温条件下，于200 r . min-1振荡提取l h后，12 000 r . min-1、4 ℃离心15 min，取上清液过0.45 μm滤膜，收集滤液即为发酵料浸提液。用pH计测定浸提液pH值，用碳元素分析仪测定浸提液的水溶性有机碳含量，按产品说明书进行。采用苏州格锐思生物科技有限公司的氨含量测定试剂盒测定浸提液的氨含量，按说明书进行。用广东环凯微生物科技有限公司的氨检测试纸条测定发酵料的氨含量时，取新鲜发酵料，手捏出水，用试纸条测水中的氨含量。水分含量测定采用烘干法，即50 ℃烘干至恒重。

取发酵结束的发酵料进行代谢组学分析，按北京诺禾致源科技股份有限公司非靶向代谢组学分析方法提取代谢物、超高效液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱（Ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）分析代谢物，使用ProteoWizard和XCMS软件进行峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等工作，利用二级质谱数据库对峰进行物质鉴定。进一步对数据进行峰面积的批次归一化和自适换算标准化处理。

菌丝生长速度测定采用划线法。染菌率/%=每组污染杂菌的袋数/每组总袋数×100。测量两茬菇产量用于计算生物学效率，生物学效率/%=平菇每袋产量（g）/平菇每袋干料质量（g）×100。

1.5 数据统计与分析

采用Excel 2003进行试验数据处理和作图，采用SPSS 20.0进行单因素显著性方差分析，用Duncan检验法进行不同处理间平均数差异显著性多重比较。

2 结果与分析

2.1 平菇培养料发酵过程中温度、pH值的变化

自建堆开始每天测定料堆中层温度和间隔1 d取样测定pH值。粉碎玉米芯小粒配制的培养料自第2天开始升温，且升温速度快，第4天即接近70 ℃，且维持70 ℃以上的时间长达4 d，直到发酵第8天才开始降温。而中粒和大粒培养料自第3天才开始升温，大粒培养料升温比中粒快，至第4天接近70 ℃，比中粒显著高出24.3 ℃，但随后迅速降温，中粒培养料直到第7天才升温至接近70 ℃，随后也同样迅速降温（图1）。表明粒径越大，玉米芯持水能力越弱，培养料的孔隙度越大，发酵过程中通过通风孔产生的烟囱效应越强，培养料温度上升慢，高溫持续时间短，影响发酵料的发酵质量。

发酵过程中，3种培养料pH值的变化基本相同，前期pH值快速降低，随后略有升高。开始阶段细菌合成有机酸和随后这些有机酸又被利用，而微生物降解产生的氨使得发酵料维持在微碱性状态。但不同的是，发酵结束大粒和中粒培养料的pH值显著高于小粒培养料（图2），可能是大粒和中粒培养料高温阶段持续时间短，高温真菌活性低，对氨的利用较少。发酵料高pH值还导致氨的挥发散失。

2.2 平菇培养料发酵过程中含水量的变化

在相同的料水质量比配制的培养料的含水量，小粒最高，其次是中粒，大粒最低，表明粒径越大，料的持水性越差。发酵过程中，3种培养料的含水量变化趋势基本相同，含水量逐渐降低，发酵结束，小粒培养料的含水量比中粒和大粒分别显著高8.04%和10.54%（图3）。

2.3 平菇培养料发酵过程中总碳、总氮含量和碳氮比的变化

发酵过程中不同粒径培养料TC含量的变化趋势相同，均呈下降趋势，发酵结束，小粒、中粒和大粒培养料中TC含量分别显著降低11.19%、15.75%和17.80%（图4-A），可能与粒径大，培养料疏松，透气性好，好气性微生物呼吸旺盛，含碳化合物被降解，以二氧化碳形式散失较多有关。

发酵过程中，中、大粒培养料TN含量的变化趋势相同而与小粒不同。中、大粒培养料TN含量在升温阶段和高温阶段保持不变，降温阶段升高，原因可能是升温阶段和高温阶段微生物代谢迅速，营养物质包括N源物质消耗快，加上氨态氮的大量挥发，TN含量降低，但由于C的消耗使得N含量相对升高，二者达到基本平衡。而在降温阶段，随着碳源物质进一步减少，TN含量相对升高。小粒培养料的TN含量在升温阶段和高温阶段均快速升高，发酵第3天、第4天和第5天分别比发酵开始时显著升高16.67%、31.11%和46.67%，原因可能是小粒培养料持水性强，疏松透气性不及中和大粒培养料，氨态氮挥发散失少，在升温阶段和高温阶段随着碳源物质的消耗，TN含量相对升高;在降温阶段，小粒培养料温度高，氨态氮挥发散失较多，TN含量略有降低（图4-B）。

发酵过程中不同粒径培养料C/N的变化趋势相同，均呈下降趋势，发酵结束，小粒、中粒和大粒培养料的C/N值接近，分别为37、35和33，比发酵开始时分别显著降低了37.13%、22.35%和32.34%（图4-C）。

2.4 平菇培养料发酵过程中水溶性有机碳含量的变化

建堆后和每次翻堆后及发酵结束取样测发酵料浸提液的DOC含量。3种培养料发酵过程中DOC含量的变化趋势基本相同，发酵早期迅速降低，随后保持稳定。可能是早期微生物对易利用物质的快速利用，随后微生物的易利用物质和分解代谢产生的易利用物质保持平衡。但不同的是，培养料起始DOC含量，3种培养料有显著差异，粒径越小，DOC含量越高，粒径小，有利于原料中水溶性成分的溶出。发酵结束，中粒和大粒培养料中DOC含量显著高于小粒，比小粒显著高121.67%和82.91%（图5）。

2.5 平菇培养料发酵过程中氨含量的变化

采用氨含量测定试剂盒测定发酵过程中平菇培养料的氨含量，粉碎玉米芯小粒、中粒和大粒分别配制的培养料发酵过程中氨含量的变化趋势相似，升温阶段和高温阶段前期，氨含量迅速升高，高温阶段后期氨含量快速降低，但发酵结束，大粒发酵料的氨含量显著低于小粒和中粒发酵料（图6），可能与发酵结束大粒发酵料的pH值（8.6）高于小粒（8.0）和中粒（8.3）有关，高碱性条件有利于氨的散失。3种发酵料发酵结束均没有氨味，用于平菇栽培，均没有发生氨抑制菌丝生长的现象。因此，平菇发酵料发酵结束氨质量分数以低于2 400 mg·kg-1为宜。

为便于现场检测发酵料氨含量，采用氨检测试纸条测定了发酵料渗出液中的氨含量，结果与用氨检测试剂盒测定的氨含量呈显著正相关（p<0.000 1），斜率是0.56，截距是8.74（图7）。根据二者的线性关系，发酵结束，小粒、中粒和大粒发酵料的氨质量分数为2 085、2 328、1 512 mg·kg-1对应的氨检测试纸条的质量浓度结果是1 171 、1 306 、851 mg·L-1。平菇发酵料发酵结束发酵料渗出液中氨质量浓度以低于1 350 mg·L-1为宜。

2.6 大、小粒径培养料发酵结束抑菌物质含量的比较

通过代谢组分析，从发酵结束的大、小粒发酵料中检测具有杂菌抑制活性的物质有17种，其中8种物质含量在小粒发酵料中显著升高。将该17种代谢物含量的峰面积进行log10变换后计算其总和，小粒发酵料中该17种杂菌抑制物质的总量显著高于大粒发酵料，比大粒发酵料高21.31%（图8），小粒培养料发酵成熟度高于大粒培养料。

2.7 发酵料栽培平菇发菌期间料温的变化

3种粒径发酵料栽培平菇，发菌期间第3层袋料温的变化趋化基本一致，前期升高，中期保持稳定，后期降低。大粒发酵料发菌期间平均料温为28.3 ℃，高于中粒（25.7 ℃）和小粒（25.3 ℃）的平均料温，3种发酵料发菌期料温比棚温分别高出12.1 ℃、9.5 ℃和9.1 ℃（图9）。大粒发酵料发菌期间料温高于中粒和小粒发酵料，可能既与大粒发酵料中DOC含量高有关，也与其疏松度高、含氧量高有关。

2.8 不同粒径发酵培养料对平菇生长和菇产量的影响

采用小、中和大粒发酵培养料栽培平菇，粒径越大，菌丝生长速度越快，满袋时间越短，但菌丝长势变差，染菌率增加，生物学效率降低（表1），应是大粒径发酵培养料DOC含量高、发菌期料温高、发酵成熟度低和抑菌物质含量低的综合表现。

3 讨论与结论

双孢蘑菇属于木质纤维素次级分解者，对其培养料发酵原理和工艺技术的研究已有80余年。双孢蘑菇培养料的发酵过程要经过二次发酵，第1次发酵是在露天或隧道内，通过微生物的活动使料堆自升温，温度几天内达到80 ℃，强烈的微生物活动降解纤维素、半纤维素和木质素等，为食用菌生长提供营养，同时产生大量的CO2和氨。第2次发酵是在隧道内进行巴氏消毒和控温培养（发酵腐熟）2个阶段。巴氏消毒阶段即是控制温度在60 ℃左右维持2～10 h，以杀死害虫、竞争性真菌和病原菌。控温培养阶段即是控制温度在45～50℃维持3～10 d，使对食用菌生长有益的微生物，包括芽孢杆菌、嗜热放线菌和嗜热真菌等生长繁殖，同化第1次发酵产生的游离的氨，氨（φ）可由0.24%降至0.001%左右，并影响发酵料的pH值[12-13]，降低培养料中易利用营养物质含量，DOC（w）由16 g·kg-1降至12 g·kg-1 以下，消除氨对食用菌的抑制作用、易利用营养物质的再发酵产热烧菌，并抑制杂菌污染[14-16]。由于双孢蘑菇对氨的耐受性较弱（接种时培养料的氨高于0.07%即会抑制菌丝的生长），人能够闻到氨味时培养料中的氨通常高于0.1%[17-18]，所以，双孢蘑菇培养料发酵度指标主要有氨0.067%、pH值7.8、含水量69.32%、DOC 6.51 g·kg-1和有益菌嗜热真菌嗜热革节孢（Scytalidium thermophilum）数量106 CFU·g-1等[14-16]。

相对于双孢蘑菇，平菇是木质纤维素的初级分解者，其培养料发酵原理和技术指标等还很缺乏。本研究发现，不同粒径的粉碎玉米芯配制的平菇培养料，发酵过程中温度、pH、DOC含量和氨含量的变化表现出较大的差异。粒径越大，玉米芯持水能力越弱，培养料的孔隙度越大，发酵过程中通过通风孔产生的烟囱效应越强，料温升温慢，高温持续时间短，影响发酵料的发酵质量，表现为发酵结束时发酵料的DOC含量高，平菇发菌阶段易再发酵导致料温偏高烧菌;杂菌抑制物质合成少，平菇发菌期染菌率高。

氨（NH3和NH4+）含量测定方法常用的是纳氏试剂比色法，但该方法所需试剂多，费时长。新近出现了简便的氨测定试剂盒法和试纸条法，如苏州格锐思生物科技有限公司开发的氨含量测定试剂盒，其原理是利用氨在强碱环境下与次氯酸盐和苯酚反应，生成水溶性染料靛酚蓝，溶液颜色稳定，在波长630 nm处有特征吸收峰，吸光值与氨含量呈正比。广东环凯微生物科技有限公司依据纳氏试剂法开发的氨检测试纸条，检测结果与纳氏试剂法一致。本研究发现，用氨含量测定试剂盒测定的发酵料浸提液中的氨含量与用氨检测试纸条测定的发酵料渗出液中的氨含量结果呈显著正相关，因此，可用氨检测试纸条法对发酵料渗出液中的氨含量进行简便的现场检测。

综上所述，平菇培养料使用的玉米芯以粉碎成小颗粒为佳，发酵结束发酵料含水量为60%～67%、pH值为8.0～8.6、发酵料DOC质量分数以低于12 g·kg-1、氨质量分数以低于2 400 mg·kg-1为宜，发酵料渗出液中氨质量浓度以低于1 350 mg·L-1为宜。

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