魏雅婷，崔 燕，张 倩，何俊峰

(甘肃农业大学动物医学院 甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心，兰州 730070)

肺离子细胞[1-2](pulmonary ionocyte)是2018年在人和小鼠肺中发现的一种新型细胞，在肺纤维化的形成机制和修复中发挥关键作用，对ATP6V0D2具有独有的免疫反应性[2]。牦牛虽长期处于高原低氧环境下，但其肺却无低氧造成的肺纤维化现象[3-4]。现有的肺离子细胞的相关研究仅限于人和小鼠，尚无其他动物的研究报道，也无ATP6V0D2在低氧环境中生活动物的研究报道。因此，本研究拟通过免疫组织化学、qPCR和Western blot技术检测ATP6V0D2在不同年龄牦牛肺中的分布和表达，确定ATP6V0D2在牦牛肺中的动态分布和表达情况、探讨ATP6V0D2在高原低氧适应动物肺结构形成和功能保持方面的可能作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

健康牦牛肺采自甘南藏族自治州(初生1～7日龄)、青海省西宁市马家肴屠宰场(幼年1～2岁和老年 7～10岁)、甘肃省临夏自治州 (成年3～6岁)，每年龄段各3头。颈动脉放血处死，迅速采集肺组织固定于4%多聚甲醛溶液和液氮中。

1.2 免疫组织化学

石蜡切片4 μm，按SP试剂盒(北京博奥森生物科技有限公司)说明书处理。ATP6V0D2抗体(Rabbit Anti-ATP6V0D2，bs-12548R，同上)1∶300稀释，空白对照用0.01 mol·L﹣1的PBS代替一抗，DAB显色，苏木精复染。深棕黄色为强阳性表达，浅棕黄色为阳性表达，接近背景色或无色为阴性。Olympus DP71显微照相系统进行拍摄。

1.3 Western blot

称0.1 g各年龄组牦牛肺组织，加入1 mL RIPA裂解液和10 μL PMSF，摇床冰浴2.5 h， 4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min，吸上清，-20 ℃保存。将提好的蛋白按比例配制，金属浴变性，进行SDS-PAGE电泳。一抗 (Mouse Anti-ATP6V0D2，ab236375，abcam；Anti-β-actin Mouse，N21123，北京全式金生物技术有限公司)，二抗1∶5 000[Goat Anti-Mouse IgG(H+L)，N21009，同上]。……